微生物檢測技術在食品檢驗中的應用分析

林更濤

摘 要：微生物檢驗是食品檢驗中的重點項目，主要檢測內容有細菌總數、大腸菌群以及多種致病菌。食品檢驗中所用的微生物檢測技術較多，需要工作人員熟悉各個細菌學項目的微生物檢測技術。細菌總數常用的微生物檢測技術有平板菌落計數法、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）法、微菌落法等；大腸菌群常用的微生物檢測技術有3M測試片法、SN標準固體培養基法、發酵法等；常見的致病菌沙門氏菌微生物檢測技術方法有SC-WS兩管法、環介導等溫擴增法、沙門氏菌快速測試片法等，應根據實驗室條件、檢驗要求等選擇適宜的檢測方法。

關鍵詞：微生物檢測技術；食品檢驗；應用

Abstract： Microbiological inspection is a key item in food inspection， the main detection content includes the total number of bacteria， coliform and a variety of pathogenic bacteria. There are many microbial detection techniques used in food inspection， and it is necessary for staff to be familiar with the microbial detection techniques of various bacteriological projects.The commonly used microbial detection techniques include plate colony counting method， 2，3， 5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） method， microcolony method， etc. The commonly used microbial detection techniques for coliform include 3M test sheet method， SN standard solid medium method， fermentation method， etc. The common microbial detection methods of pathogenic bacteria salmonella include SC-WS two-tube method， ring mediated isothermal amplification method， salmonella rapid test sheet method， etc. Appropriate detection methods should be selected according to laboratory conditions and inspection requirements.

Keywords： microbiological testing techniques; food inspection; applications

食品安全關系到人們的切身利益，近年來頻發的食品安全問題廣受關注，已成為社會中的重大問題。微生物因素所致的食品安全問題比較常見，全球每年約有6億人因食用微生物污染的食品而導致腹瀉，食品安全問題應給予高度重視，并采取有效的防范措施[1]。微生物檢測技術是一類技術的統稱，主要檢測食品中的菌落總數、大腸菌群、致病菌等。微生物檢測可以反映食品中的微生物種類、數量，對預防及控制食源性疾病、保證食品安全有重要的指導意義。本文主要介紹食品檢驗中幾種常見微生物檢驗項目的微生物檢測方法及其優缺點，旨在更好地服務于今后的食品檢驗工作。

1 微生物檢測的意義

食品大致可以分為2種，即植物性食物、動物性食物，各種微生物分布其中，可以通過微生物檢測技術進行檢測。有害微生物是食品檢驗中的重點，微生物檢測安全、快速、準確以及成本低。微生物檢測在食品檢驗中應用廣泛，可以用于食品生產過程監控、食品安全評價、食品安全監管和食品科學研究等領域，還可以用于防控食源性疾病發生。在發生食源性疾病時，可以用于追溯原因、消除隱患[2]。

2 食品微生物檢測技術及應用

2.1 食品檢驗中細菌總數的微生物檢測技術

常用的方法有平板菌落計數法、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）法、微菌落法等[3]。

細菌總數檢測方法中，國家標準方法是平板菌落計數法，該方法將食品樣品制備成溶液，使微生物分散成單個細胞，再將稀釋的溶液涂在平板上，加入營養瓊脂，放入培養箱中培養48 h，使微生物在平板上繁殖成為可見的菌落，取出后進行菌落計數[4]。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物熒光法將食品樣品制備成為待測溶液，濾掉懸浮顆粒物，取待測液放入測試管，加入熒光素酶試劑，添加稀釋液，混勻，10 s內讀數，減去空白值，記為樣品中ATP發光強度，再進行定量分析。TTC法先配置培養基，采用傾注平板法，放入恒溫培養箱內培養48 h，取出后觀察顯色效果和菌落大小，并計數。微菌落法將消毒后的微孔濾膜放在抽濾系統上，根據食品種類加樣1 mL，連續真空泵抽濾，每個樣做2個平行樣，將濾膜放在恒溫培養箱內室溫培養3～5 h，取出膜，干燥處理，用透明液固定，放在載玻片上微熱透明，加蓋玻片，加熱固定，冷卻后染色，放在顯微鏡下觀察、拍照，計數菌落總數。

平板菌落計數法具有操作容易、技術壁壘低、可以計數和可以觀察菌落特征等優勢，但吸收量少、容易蔓延、檢測耗費時間長、容易受環境雜菌干擾[5]。TTC法檢測成本低、簡便、快速，但檢查耗費時間長、靈敏度低、操作復雜。微菌落法操作簡便，對設備要求不高，但檢測時間較長[6]。

2.2 食品檢驗中大腸菌群的微生物檢測技術

大腸菌群檢驗方法有3M測試片法、SN標準固體培養基法、發酵法等[7]。①3M測試片法。將食品樣品稀釋成樣品稀釋液，取稀釋液接種至大腸菌群測試片上，放入恒溫培養箱中培養24 h，取出觀察，選取有氣泡的紅色菌落計數，計算平行樣的平均值，得出大腸菌群數。②SN標準固體培養基法。將食品樣品稀釋，制備待測溶液，取稀釋液接種于平皿，加入培養基培養18～24 h，取出觀察。選取紫紅色、周圍有紅色的膽鹽沉淀環的菌落，轉種至煌綠乳糖膽鹽肉湯，放入培養箱內培養48 h，觀察產酸產氣情況，計算大腸菌群數。③發酵法。乳糖發酵，將食品樣品制備成為可檢測的待測溶液，取待測溶液分成3份，按照不同濃度稀釋，分別接種乳糖膽鹽發酵管，放在恒溫培養箱中培養4 h，觀察產氣情況。分離培養，選出乳糖發酵中產氣的發酵管，轉種至伊紅美藍瓊脂平板上，放入恒溫培養箱培養18～24 h，觀察產氣情況，并進行革蘭氏染色、鏡檢。開展復發酵試驗，選出分離培養中產氣的發酵管，挑選可疑菌落進行革蘭氏染色，并接種至乳糖發酵管，放入恒溫培養箱中培養24 h。若發酵管產氣、革蘭氏染色為陰性反應的無芽孢桿菌，則提示大腸菌群陽性。④快速熒光法。將待測溶液加入含有4-甲基傘形酮-β-半乳萄糖苷肉湯管中，放入恒溫培養箱中培養24 h，使用紫外燈照射觀察，如果有可見熒光，則提示大腸菌群陽性。3M測試片法檢測快速，可以縮短2～5 d的微生物檢測時間，節省人力物力，檢測成本低，但容易受到外界因素的影響[8]。SN標準固體培養基法的優點是操作簡便、設備投入少、檢測成本低廉、幾乎不產生污水，不足之處是檢測效率低、勞動量大、不易自動化[9]。發酵法的優點是容易、準確度高、價格便宜、易于推廣，不足之處是操作步驟煩瑣，耗費時間長，培養基保存時間短[10]。

2.3 食品檢驗中沙門氏菌的微生物檢測技術

食品中沙門氏菌的微生物檢測技術有SC-WS兩管法、沙門氏菌快速測試片法等[11]。①SC-WS兩管法。取食品樣品制備成待測溶液，放入恒溫培養箱中培養8～18 h。取1 mL培養過的樣品混合物接種于四硫磺酸鈉煌綠增菌液，42 ℃培養18～24 h，另取1 mL轉種于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，36 ℃培養18～24 h。取增菌液接種于亞硫酸鉍瓊脂平板、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂平板，或采用HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養基平板，36 ℃培養18～24 h，其中亞硫酸鉍瓊脂平板延長至40～48 h，觀察各平板上的菌落并鑒定。②環介導等溫擴增法。將分離的沙門氏菌接種在營養肉湯中，室溫培養過夜，取0.5 mL離心，取沉淀加滅菌雙蒸水重懸，水浴煮沸，再次離心，取上清，用無菌雙蒸水調整脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）濃度作為模板。根據沙門氏菌的invA基因的6段序列，應用軟件設計引物。按照DNA擴增試劑盒說明書進行擴增，設置陰性對照、陽性對照，擴增反應結束后，反應液變為綠色說明為陽性。③沙門氏菌快速測試片法。先進行增菌培養8～24 h，培養溫度41.5 ℃。將3M沙門氏菌SALX測試片放在平坦的表面，于測試片中心滴加無菌水進行水化，將3M壓板放在測試片中心，加壓，使無菌水均勻分布，室溫避光靜置1 h。蘸取樣品從上至下劃線使菌落分離，將膜放下，著色面朝上水平放置，41.5 ℃培養24 h。選出有黃色暈圈、伴或不伴氣泡的紅色菌落標記測試片。去除測試片最上層的膜，插入3M PetriflmTM SALX確認片，41.5 ℃培養4～5 h，標記的部位若出現有藍色沉淀的黑色菌落，或者黑色菌落中心伴深紅色或藍色沉淀，視為沙門氏菌陽性。④聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）法。提取食品樣品中細菌基因組DNA，準備裝有反應液的PCR管，添加模板，設置空白對照、陰性對照、陽性對照，進行PCR擴增反應，使用熒光定量PCR儀檢測，根據檢測結果判定是否含有沙門氏菌[12]。⑤電阻抗法。取樣品接種于乳糖肉湯中，添加標準菌株，放在恒溫培養箱中24 h前增菌，取培養過的混合物1 mL，加入裝有電阻抗選擇培養基Ⅰ、Ⅱ的電阻抗測量瓶中，搖勻，使用電阻抗測量儀檢測，并設置陰性對照（未加樣品的電阻抗選擇培養基測量瓶），24 h內培養基電阻抗變化值超過5%視為陽性。

SC-WS兩管法的優點是檢測靈敏度高、符合率高，不足之處是檢測時間長。環介導等溫擴增法具有簡便、快速、精確、靈敏度高和特異性強的優點，檢測成本遠低于熒光PCR。PCR法具有操作簡便、檢測時間短等優勢，但容易出現假陽性，導致結果誤判[13]。電阻抗法的優點是高敏感性、高特異性、可重復性好和檢測時間短，但用于大量樣品檢測所需時間仍然較長，推廣應用受限。

2.4 其他致病菌檢驗中的微生物檢測技術

食品微生物檢驗中，常檢驗的致病菌有單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等[14]。①單增李斯特菌的微生物檢測技術有最大或然數（Most Probable Number， MPN）法、3M紙片法等[15-16]。MPN計數法將不同稀釋度的稀釋液作為原液，分別接種至李氏增菌肉湯中，30 ℃培養過夜，將培養物轉種于科馬嘉顯色培養基上，37 ℃下培養24 h，再進行MPN計數。3M紙片法將測試片平放在水平操作臺上，分別取不同稀釋度的菌液1 mL，滴在測試片中心位置，用壓板輕輕壓下，放入培養箱中37 ℃培養18 h，對結果進行判讀。②金黃色葡萄球菌的微生物檢測技術需提取金黃色葡萄球菌DNA，設計特異性引物序列，建立反應體系，進行PCR擴增，將擴增產物進行電泳，利用凝膠成像系統觀察結果。

3 結語

微生物污染是影響食品安全的重要原因，微生物檢驗是食品檢驗的重點項目，檢驗內容主要為細菌學檢驗，包括細菌總數、大腸菌群及各類致病菌，如沙門氏菌、單增李斯特菌等。不同微生物的檢測應挑選適宜的微生物檢測技術，確保檢測結果的準確性。

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