芪黃湯治療免疫性血小板減少癥的療效及對細胞相關因子和外周血T淋巴細胞程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1的影響※

周 林 戴 燚 劉毓玲

(1.湖北省武漢市中醫醫院檢驗科,湖北 武漢 430050;2.湖北省武漢市中醫醫院綜合病區,湖北 武漢 430050)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病,由于體內免疫失衡導致血小板破壞增多、生成減少而導致以皮膚黏膜出血以及內臟出血為特征的一種自身免疫性疾病[1]。ITP是臨床最為常見的出血性疾病,成人發病率為5～10/10萬,育齡期女性發病率高于男性,60歲以上老年人是該病的高發群體[2]。ITP治療策略在于阻止血小板過度破壞和促血小板生成,使血小板計數維持在安全水平內,控制出血[3]。2018年6月至2020年12月,我們在糖皮質激素治療基礎上應用芪黃湯治療ITP 45例,并與糖皮質激素治療45例對照,觀察療效及對細胞相關因子和外周血淋巴細胞程序性死亡受體-1(PD-1)/程序性死亡配體-1(PD-L1)的影響,結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部90例均為我院綜合科住院患者,按照隨機數字表法分為2組。治療組45例,男17例,女28例;年齡18～80歲,平均(58.4±3.9)歲;病程4～50個月,平均(20.8±10.1)個月;體質量指數(BMI)21.65±5.47。對照組45例,男20例,女25例;年齡20～75歲,平均(60.1±2.3)歲;病程5～45個月,平均(22.3±9.5)個月;BMI 20.63±6.78。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準 參照《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[2]中ITP的診斷標準。

1.2.2 納入標準 年齡18～80歲;3個月內未接受過糖皮質激素治療的患者;臨床資料完整;本研究經醫院醫學倫理委員會通過,患者自愿簽署知情同意書。

1.2.3 排除標準 參與研究前接受過血小板輸注或糖皮質激素治療者;因其他疾病接受過糖皮質激素治療或有糖皮質激素禁忌證等;妊娠或哺乳期女性患者;合并嚴重肝腎功能不全者;其他繼發性血小板減少癥。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 予糖皮質激素治療。氫化可的松琥珀酸鈉(天津生物化學制藥有限公司,國藥準字H12020493)50～100 mg/d,加入0.9%氯化鈉注射液100 mL中,每日1次靜脈滴注,治療5天。血小板(PLT)計數>80×109/L予醋酸潑尼松片(山東魯抗醫藥集團賽特有限公司,國藥準字H20033023)1.5～2 mg/(kg·d)口服,治療1～2周,緩慢減量后以10 mg/d維持治療。

1.3.2 治療組 在對照組治療基礎上加芪黃湯。藥物組成:黃芪15 g,生地黃15 g,熟地黃15 g,白術12 g,茯苓15 g,女貞子15 g,墨旱蓮15 g,太子參15 g,菟絲子15 g,枸杞15 g,山藥18 g,豆蔻12 g。日1劑,水煎2次取汁400 mL,分早、晚2次服。

1.3.3 療程 2組均治療2個月。

1.4 觀察指標及方法 ①ITP出血評分[2]:年齡≥65歲1分,≥75歲2分;皮膚(淤點/淤斑/皮下血腫),頭面部2分,其他部位1分;黏膜(鼻出血/牙齦出血/口腔血皰/結膜出血),偶發、可自止2分,多發、持續不止3分,伴貧血5分;深部器官(內臟出血如肺、胃腸道、泌尿生殖系統),不伴貧血3分,伴貧血5分,危及生命8分;中樞神經系統8分。②用EDTA-K2抗凝管采集患者靜脈血2 mL,采用SYSMEX XT-1800i型全自動血液分析儀檢測PLT計數;分離膠促凝管采集靜脈血4 mL,離心取血清,采用Rayto RT-6000型酶標分析儀,采用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血小板相關抗體(PAIg)G、PAIgM、干擾素γ(IFN-γ)、白細胞介素10(IL-10)、轉化生長因子-β(TGF-β)、IL-17;EDTA-K2抗凝管采集靜脈血2 mL,采用BD FACS Calibur型流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+百分比。

1.5 療效標準[2]完全反應:治療后PLT計數≥100×109/L且無出血;有效:治療后PLT計數≥30×109/L且至少比基礎PLT計數增加2倍,且無出血;無效:治療后PLT計數<30×109/L或PLT計數增加不到基礎值的2倍或有出血。在定義完全反應或有效時,應至少檢測2次,期間至少間隔7天。復發:治療有效后,PLT計數<30×109/L或PLT計數降至不到基礎值的2倍或出現出血癥狀,定義復發時至少檢測2次PLT計數,期間至少間隔1天?？傆行?(完全反應例數+有效例數)/總例數×100%。復發率=復發例數/(完全反應例數+有效例數)×100%。

2 結果

2.1 2組療效比較 治療組總有效率86.67%(39/45),復發率10.26%(4/39);對照組總有效率68.89%(31/45),復發率29.03%(9/31)。治療組療效優于對照組(P<0.05),復發率低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組療效比較 例

2.2 2組治療前后ITP出血評分比較 2組治療后ITP出血評分均較本組治療前降低(P<0.05),且治療組降低更明顯(P<0.05),比較差異有統計學意義。見表2。

表2 2組治療前后ITP出血評分比較 分,

2.3 2組治療前后PLT計數、PAIgG、PAIgM比較 2組治療后PLT計數較本組治療前升高(P<0.05),PAIgG、PAIgM均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組PLT計數高于對照組(P<0.05),PAIgG、PAIgM均低于對照組(P<0.05),比較差異有統計學意義。見表3。

表3 2組治療前后PLT、PAIgG、PAIgM比較

2.4 2組治療前后IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-17水平比較 2組治療后IFN-γ、IL-17水平均較本組治療前降低(P<0.05),IL-10、TGF-β水平較本組治療前升高(P<0.05);治療后治療組IFN-γ、IL-17水平均低于對照組(P<0.05),IL-10、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組治療前后IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-17水平比較

2.5 2組治療前后外周血T淋巴細胞PD-1/PD-L1水平比較 2組治療后外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+水平均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+水平均低于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 2組治療前后外周血T淋巴細胞PD-1/PD-L1水平比較

3 討論

ITP的發病機制有自身抗體產生、機體免疫耐受失衡、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)介導的血小板破壞、骨髓巨核細胞發育成熟障礙及血小板生成減少[4-5]。

目前,現代醫學治療ITP主要應用糖皮質激素、免疫抑制劑及無效病例切脾等,但有相當部分病例治療后反復遷延不愈而轉化為難治性ITP,需要中醫藥輔助或支撐治療。

ITP屬中醫學血證、紫斑、肌衄、葡萄疫等范疇,本病起病緩慢,病程遷延,臨床表現為皮膚出現青紫斑點和斑塊,還有頭暈乏力、舌淡苔白、脈細無力等脾腎虛損之候。《諸病源候論·傷寒病諸候》提出“熱毒乘虛,出于皮膚,所以發斑瘡隱疹如錦紋”?！毒霸廊珪ぱC》提出“血本陰精,不宜動也,而動則為病;營氣,不易損也,而損則為病。蓋動者多因于火,火盛則逼血妄行;損者多由于氣,氣傷則血無以存”?，F代中醫提出,ITP外因為風寒火濕邪毒侵襲營血,內因為氣血陰陽虧虛、血溢脈外,病機特點為陰虛火旺、氣不攝血、熱迫血行、瘀血阻滯,且這四種形式往往相互交錯而又相互影響;脾腎虛弱是其病理基礎,且貫穿疾病的全程,及脾者以脾不統血證候多見,及腎者以陰虛內熱,血熱妄行多見;歸納概括為外感溫熱病邪及內有臟腑虛損,導致機體臟腑、陰陽氣血失調,血不循經而出血[6-7]。芪黃湯方中黃芪、地黃為君藥,黃芪甘溫,健脾益腎,補氣固表,升提攝血;生地黃清熱涼血,止血,養陰生津,熟地黃補血滋陰,益精填髓,兩者配伍,生津補血,健脾益氣,滋陰補腎,清熱涼血。白術、茯苓、女貞子、墨旱蓮共為臣藥,脾為氣血之源,主中氣而統血,黃芪合白術、茯苓益氣健脾增益明顯。白術補益健脾,燥濕利水。墨旱蓮甘、酸而寒,入肝、腎二經,補益肝腎之陰,涼血止血,補中有清,為清補之品,與女貞子配伍,既能補益肝腎,又能滋陰止血[8]。太子參益氣生津;菟絲子、枸杞、山藥滋陰補腎,培元固本;豆蔻化濕消痞,行氣溫中,共為佐、使藥。全方配伍合理,主從有序,方證相合,運用益氣攝血、清熱涼血、補虛扶正、健脾益氣之法,標本兼治?，F代藥理研究表明,黃芪多糖能調節細胞免疫,通過增加脾淋巴細胞而改善模型小鼠脾臟指數,從而促進血小板生成[9],能促進小鼠骨髓的恢復及外周三系血細胞的恢復[10];黃芪糖蛋白可通過不同程度促進Treg細胞的分化增殖,抑制輔助性T淋巴細胞17(Th17)的分化增殖,有效恢復Th17/Treg細胞平衡[11];熟地黃多糖對外周血象、骨髓有核細胞下降均有拮抗作用,對造血干細胞具有促進增殖、分化作用,地黃苷D可明顯提高血小板數[12];白術內酯與白術多糖通過抑制炎癥因子、調節免疫等方式治療免疫系統疾病[13];茯苓酸通過抑制IFN-γ分泌,抑制CTL對靶細胞的殺傷[14];女貞子中紅景天苷可通過提高其特異性免疫功能、巨噬細胞吞噬功能、機體非特異免疫功能、阻止骨髓細胞凋亡、誘導造血干細胞增殖分化等,從而調節其免疫功能[15]。

本研究結果顯示,治療組總有效率高于對照組(P<0.05),復發率低于對照組(P<0.05);治療后治療組ITP出血評分低于對照組(P<0.05)。說明芪黃湯聯用糖皮質激素較單獨使用糖皮質激素治療ITP具有更高的總有效率及更低的復發率,且ITP出血評分更低[16]。

血小板生成減少及自身抗體產生是ITP發病中重要的臨床指標,患者血清主要檢測到IgG及IgM型血小板抗體。本研究結果顯示,2組治療后PLT計數較治療前升高(P<0.05),PAIgG、PAIgM均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組PLT計數高于對照組(P<0.05),PAIgG、PAIgM均低于對照組(P<0.05)。表明芪黃湯恢復患者PLT計數及減少血小板抗體較對照組具有更好療效。

有研究發現,CD4+T淋巴細胞亞群的比例失調及其分泌的細胞因子失衡參與了ITP的發生發展[17]。ITP患者Th1/Th2失衡,Th1型占優勢表達,且與疾病嚴重程度呈正相關[18],ITP患者同時存在Th17/Treg比例失衡[19]。IFN-γ來源于Th1細胞,促炎作用強,在疾病的發展中起主要作用,IL-10來源于Th2細胞,Th1和Th2之間通過分泌細胞因子相互制約,維持動態免疫平衡。Th17細胞分泌IL-17在ITP患者中明顯增高[20],Treg細胞分泌TGF-β則引起免疫耐受,兩者之間的動態平衡在維持機體免疫狀態穩定中發揮重要作用。本研究結果發現,2組治療后IFN-γ、IL-17水平均較本組治療前降低(P<0.05),IL-10、TGF-β水平較本組治療前升高(P<0.05);治療后治療組IFN-γ、IL-17水平均低于對照組(P<0.05),IL-10、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05),提示芪黃湯可能通過降低Th1、Th17細胞因子表達,提高Th2、Treg細胞因子表達從而調整Th1/Th2和Th17/Treg平衡,達到治療效果。

有研究表明,ITP患者CD4+T淋巴細胞表面PD-1比例升高,并且PD-1/PD-L1升高與ITP患者疾病活動程度有一定關系[21]。PD-1是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體,屬于免疫球蛋白CD28家族,表達于活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、單核細胞和樹突狀細胞等多種免疫細胞,在維持淋巴細胞穩態方面起關鍵作用;PD-1的配體PD-L1是Ⅰ型跨膜蛋白受體B7家族的成員,廣泛表達于T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質干細胞、骨髓來源的肥大細胞和一些非造血細胞[22-23]。PD-1/PD-L1在T淋巴細胞成熟、分化和增殖過程中能夠提供負性共刺激信號,在機體免疫功能異?？哼M時代償性分泌增多,參與多種自身免疫性疾病的發生及發展過程[24-25]。本研究結果發現,2組治療后外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+水平均較本組治療前降低(P<0.05);治療后治療組外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+水平均低于對照組(P<0.05),提示芪黃湯可能通過調節CD4+T淋巴細胞PD-1/PD-L1信號,使其處于低表達,免疫功能亢進被抑制,進而改善病情。

綜上所述,芪黃湯治療ITP,可提高患者PLT計數,降低PAIg水平和ITP出血評分,其機制可能與減少IFN-γ、IL-17分泌水平、提高IL-10、TGF-β表達水平,從而調節Th1/Th2和Th17/Treg免疫平衡、降低CD4+T淋巴細胞PD-1/PD-L1信號表達水平來干預細胞免疫環境相關。