淫羊藿對慶大霉素誘導急性腎損傷大鼠腎功能的保護作用

王燕萍，陳軍輝，白瑞斌，宋平平，曹陽洋，胡芳弟*

（1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI） 主要表現為腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR） 迅速下降以及含氮廢物的滯留，通常與膿毒癥、心血管衰竭、充血性心力衰竭、大型手術、腎臟毒素或尿路梗阻有關。慶大霉素是治療革蘭氏陰性菌引起感染的一種氨基糖苷類抗生素，臨床上10%～30% 接受過慶大霉素治療的患者會產生AKI［1］。慶大霉素誘導腎損傷的具體機制目前尚不完全清楚，但是慶大霉素誘導的腎損傷能產生氧化應激反應，表現為脂質過氧化水平增加，抗氧化酶活性降低等［2］，AKI患者的氧化應激反應增加，導致腎功能障礙的發生［3-4］；同時，慶大霉素可嚴重損傷腎組織結構，出現大面積組織壞死，腎小管空泡化，腎小球皺縮，細胞排列疏松，刷狀緣不規則等現象［5］。

淫羊藿來源于小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai 的干燥葉［6］。現代藥理學研究表明淫羊藿具有增強免疫［7］、抑制腫瘤［8-9］、抗炎［10］、抗骨質疏松［11-13］、抗氧化［14］等多種藥理活性。楊舸［15］研究發現，淫羊藿總黃酮可以通過改善氧化應激，減少炎癥反應，通過抗凋亡途徑來減少順鉑引起的小鼠腎損傷。目前尚未見到與淫羊藿臨床及實際應用相關的提取物對慶大霉素引起的AKI 保護作用的報道。淫羊藿作為補益類中藥，在臨床和日常生活中以中藥湯劑和藥酒2 種形式使用，因此本實驗研究淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物對慶大霉素誘導AKI 大鼠的保護作用，并探究淫羊藿發揮腎保護作用的機制。

1 材料

1.1 動物 80 只SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質量（220±20） g，由蘭州大學實驗動物中心提供［實驗動物生產許可證號SCXK （甘） 2019-0002］，飼養于12 h／12 h 晝夜循環、（25±2） ℃環境，提供充足的飼料和水。上述所有程序均按照世界醫學會的道德規范執行，實驗方案通過了蘭州大學藥學院倫理委員會的批準。

1.2 試劑與藥物 慶大霉素、4%組織細胞固定液（貨號G8170、P1110，北京索萊寶科技有限公司）；NO、BUN、UA、Cr、T-SOD、CAT、MDA 檢測試劑盒（貨號A013-2-1、C013-2-1、C012-2-1、C011-2-1、A001-1-2、A007-2-1、A003-1-2，南京建成生物工程研究所）；IL-10 檢測試劑盒（批號3947，江蘇酶免實業有限公司）。淫羊藿野生品于2019 年5 月初采自甘肅省禮縣中壩鄉，自然陰干，經甘肅中醫藥大學附屬醫院楊錫倉主任藥師鑒定為淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.的干燥葉。

1.3 儀器 腎臟腎小球濾過率監測裝置（NIC-Kidney，型號UD0877，德國曼海姆公司）；酶標儀（型號infiniteF50，上海博源生科技有限公司）。

2 方法

2.1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物的制備及黃酮含量測定 取淫羊藿粉末（過3 號篩） 300 g，加入30 倍量水，煎煮提取1 h，同法重復3 次，過濾后合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得淫羊藿水提取物，得率為19.85%。另取淫羊藿粉末（過3 號篩） 300 g，加入30 倍量70% 乙醇，回流提取1 h，同法重復3 次，過濾后合并濾液，減壓濃縮后冷凍干燥，得淫羊藿70% 乙醇提取物，得率為21.45%。淫羊藿中主要有效成分為黃酮類［16］，其中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和寶藿苷I （以下簡稱5 種黃酮） 的含量較高且具有廣泛的活性［17］，本實驗分別采用紫外分光光度法和HPLC-DAD 法對淫羊藿水提物和淫羊藿70%乙醇提取物中的總黃酮和5 種主要黃酮含量進行測定。

2.2 動物分組、造模和給藥 大鼠適應性飼養1 周后，隨機分為空白組、模型組和淫羊藿水提取物、70% 乙醇提取物低、中、高劑量組（100、170、300 mg／kg，約為臨床等效劑量的1／1.732、1、1.732 倍），淫羊藿各提取物各劑量組灌胃給予相應劑量藥物，空白組和模型組灌胃給予生理鹽水，連續給藥15 d。第6 天開始，除空白組外，其余各組大鼠腹腔注射慶大霉素（100 mg／kg），連續10 d，以誘導建立大鼠AKI 模型。

2.3 取材 最后一次給藥，大鼠腹主動脈采血，離心分離血清，保存備用。取腎組織，除去脂肪和結締組織，在生理鹽水中漂洗，取一部分置于4%組織細胞固定液中，固定24 h 后包埋在石蠟中，用于組織學研究；另一部分保存在-80 ℃冰箱中，用于Western blot 檢測。

2.4 腎小球濾過率測定 給藥結束24 h 后，將大鼠麻醉，剃除耳朵下方上背部的所有毛發以減少對FITC-sinistrin 測量的干擾。光學設備采集基線熒光2 min 后通過尾靜脈注射FITC-sinistrin （溶于0.9% 生理鹽水，劑量5 mg／100 g，注射量為0.2 mL／100 g），通過微型光學設備NIC-Kidney，對FITC-sinistrin 進行實時監測，測量連續熒光2 h，并使用MPD Lab Ver 1.0RC3 軟件分析清除曲線。使用一室模型，計算FITC-sinistrin 的清除半衰期（t1／2），并采用由制造商開發和驗證的半經驗方程將t1／2值轉換為GFR 值［mL／（min·100 g-1）］，公式為GFR＝31.26／t1／2［18］。

2.5 血清腎功能、氧化應激及炎癥因子水平檢測 按照相應試劑盒說明書檢測血清BUN、UA、Cr、MDA、IL-10、NO 水平和T-SOD、CAT 活性。

2.6 組織病理學分析 將腎組織固定在4%組織細胞固定液中24 h 以上，然后用75%乙醇脫水并包埋在石蠟中，切成4 μm 厚的切片，HE 染色后于光學顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot 法檢測腎組織Bax、Bcl-2 蛋白表達 用預冷的PBS 沖洗腎組織，取部分腎組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液于冰上放置30 min，勻漿后于4 ℃下12 000 r／min 離心5 min，收集上清液，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸5 min進行變性。經電泳、轉膜、封閉、孵育一抗二抗后顯色發光，分析條帶灰度值。

2.8 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮和5 種黃酮含量 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮的平均含量分別為35.24%和50.01%。與淫羊藿水提取物比較，淫羊藿70%乙醇提取物中各主要黃酮含量和總黃酮含量均較高，其中朝藿定A、朝藿定C，淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ以及總黃酮的含量差異具有顯著性（P＜0.01），見表1。

表1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮和5 種黃酮含量比較（%，±s，n＝3）

表1 淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物中總黃酮和5 種黃酮含量比較（%，±s，n＝3）

注：與淫羊藿水提取物比較，**P＜0.01。

提取物朝藿定A朝藿定B朝藿定C淫羊藿苷寶藿苷I總黃酮淫羊藿水提取物1.93±0.303.06±0.667.05±0.2513.05±0.010.48±0.2335.24±4.67淫羊藿70%乙醇提取物2.65±0.63** 3.38±0.0510.35±0.08**20.84±0.89**1.29±0.24**50.01±0.34**

3.2 淫羊藿對腎損傷大鼠腎功能的影響 與空白組比較，模型組大鼠GFR 值降低（P＜0.01），血清UA、BUN 和Cr水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，淫羊藿水提取物各劑量組血清UA、BUN 和Cr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），淫羊藿水提取物高劑量組GFR 值升高（P＜0.01）；淫羊藿70%乙醇提取物各劑量組GFR 值升高（P＜0.05，P＜0.01），Cr 水平降低（P＜0.01），UA 和BUN 水平無明顯變化（P＞0.05），見圖1。

圖1 淫羊藿對腎損傷大鼠腎功能的影響（±s，n＝10）

3.3 淫羊藿對腎損傷大鼠腎組織病理學的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織病理損傷明顯，近曲小管上皮細胞出現不同階段的變性，除了上皮細胞空泡化和偶爾的脫屑外，還觀察到腎小管壞死，間質顯示水腫，輕度炎癥細胞浸潤和外滲紅細胞增加；與模型組比較，淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物組大鼠腎組織上述損傷得到改善，表現為腎小管壞死、上皮細胞空泡化和外滲紅細胞減少，見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織病理HE 染色（×200）

3.4 淫羊藿對腎損傷大鼠血清MDA 水平和SOD、CAT 活性的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清MDA 水平升高（P＜0.01），T-SOD、CAT 活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物各劑量組SOD、CAT 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），淫羊藿水提取物各劑量組和70%乙醇提取物低劑量組MDA 水平降低（P＜0.01）。

圖3 淫羊藿對腎損傷大鼠血清MDA 水平和SOD、CAT 活性的影響（±s，n＝10）

3.5 淫羊藿對腎損傷大鼠血清NO、IL-10 水平的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組大鼠血清NO 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，淫羊藿水提取物和70% 乙醇提取物各劑量組NO 水平降低（P＜0.01），IL-10 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 淫羊藿對腎損傷大鼠血清NO、IL-10 水平的影響（±s，n＝10）

3.6 淫羊藿對腎損傷大鼠腎組織Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響 與空白組比較，慶大霉素處理可以升高大鼠的Bax 蛋白表達（P＜0.01），降低Bcl-2 蛋白表達（P＜0.01）。與模型組比較，損傷大鼠給予淫羊藿水提物和70%乙醇提取物可以降低Bax 蛋白表達（P＜0.01），升高Bcl-2 蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。

圖5 淫羊藿對腎損傷大鼠腎組織Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響（±s，n＝10）

4 討論

慶大霉素是氨基糖苷類抗菌藥物，因其對革蘭陰性菌和腸球菌等感染具有顯著的療效而被廣泛應用于臨床，但其容易引發腎臟功能的損傷。慶大霉素的腎毒性機制主要有①慶大霉素在近端腎小管上皮細胞積聚后導致上皮細胞缺血或壞死等［19］；②慶大霉素可降低GFR，升高血清中Cr和BUN 水平［5］。有研究表明，血清中UA 的增加也會導致腎功能的減退［20］。因此，GFR 水平，血清Cr、BUN 和UA水平均可作為評價腎功能的指標。本實驗結果顯示，大鼠給予慶大霉素造模后，GFR 降低，而血清Cr、BUN 和UA水平升高，采用淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物治療后，可逆轉上述影響，說明淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物均具有腎保護的作用。

急性腎損傷的發病與氧化應激反應、炎癥反應和線粒體功能等密切相關，氧化應激相關的特征性指標主要包括MDA、T-SOD、CAT 等［21-22］。MDA 是脂質過氧化的產物之一，其水平可以反映脂質過氧化的程度。T-SOD 是生物體內的一種重要抗氧化酶，它可以保護生物體免受超氧陰離子自由基的損害，維持氧自由基的平衡，從而維護細胞和組織的正常功能。CAT 的主要作用是催化過氧化氫（H2O2） 分解為水和氧氣，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是氧化應激過程中的關鍵酶之一。本研究結果顯示，模型組大鼠血清MDA 水平升高，T-SOD和CAT 活性降低；給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物后，MDA 水平降低，T-SOD 和CAT 活性升高。上述研究結果顯示，淫羊藿提取物可通過抑制氧化應激而發揮腎保護作用。

研究表明適量的NO 可以擴張腎小球系膜，改善腎小管和腎小球的不良情況。然而，過量的NO 可能會降低腎組織的抗氧化作用，導致腎損傷。降低NO 水平后，腎損傷得到明顯改善，功能作用得到提升［23］。本研究結果顯示，模型組大鼠血清NO 水平升高；而給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物干預后，血清NO 水平降低。IL-10 也是反映炎癥及氧化應激的重要指標，具有腎保護作用［24］。本研究結果發現，模型組大鼠血清IL-10 水平降低；給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物后，血清IL-10 水平增加。上述研究結果顯示，淫羊藿提取物可抑制慶大霉素導致急性腎損傷大鼠體內的炎癥水平，從而發揮腎保護的作用。

Bcl-2 和Bax 蛋白分別是Bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促進凋亡的蛋白，是一對重要的正負調節細胞凋亡的蛋白，編碼的Bax 蛋白可與Bcl-2 之間形成二聚體，從而對Bcl-2 蛋白產生抑制。因此，Bcl-2 和Bax 蛋白表達是評價細胞凋亡的關鍵指標［25-26］。本研究結果發現，模型組大鼠腎組織Bax 蛋白表達升高，Bcl-2 蛋白表達降低；給予淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物后，Bax 蛋白表達降低，Bcl-2 蛋白表達升高，說明淫羊藿提取物可通過調節細胞凋亡，從而達到保護腎組織的作用。

綜上所述，淫羊藿水提取物和70%乙醇提取物對慶大霉素誘導的急性腎損傷有一定的保護作用，其作用機理可能與抑制氧化應激、炎癥和凋亡有關。