外周血NK細胞和細胞因子在妊娠期糖尿病患者中的表達及臨床意義

沈夢塵，林晶，鐘建容，4，王曦，4，陳蕾*

(1.中國人民解放軍總醫院第六醫學中心婦產科,北京 100048;2. 安徽醫科大學海軍臨床學院,北京 100048;3.安徽醫科大學第五臨床學院,合肥 230032;4.華南理工大學醫學院,廣州 510006)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是一種常見的妊娠并發癥,主要表現為妊娠期間出現的自發性高血糖[1]。目前關于GDM的具體發病機制尚不完全清楚。有學者認為,GDM患者不僅存在胰島素抵抗和胰島β細胞功能的缺陷,同時也存在低度炎癥和免疫功能紊亂[2-3]。自然殺傷細胞(Nature killer cell,NK)作為機體免疫系統中的重要組成部分,主要通過產生細胞因子、趨化因子參與機體的炎癥反應及免疫調節等[4-5]。因此,闡明GDM與NK細胞間的關系對GDM及其慢性并發癥的防治具有重要意義。本文擬探討NK細胞功能與GDM胰島素抵抗的相關性,以期為GDM的預防和治療開辟新的途徑。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020年12月至2021年10月中國人民解放軍總醫院第六醫學中心婦產科收治的30例妊娠期糖尿病患者(GDM組)的病歷資料。納入標準:符合GDM診斷的孕婦,采用國際糖尿病與妊娠協會研究小組(IADPSG)標準[6],既往未診斷為糖尿病的孕婦在妊娠24～28周行75 g 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT),當血糖值符合以下一項或多項標準時,診斷為GDM:空腹血糖≥5.1 mmol/L,口服葡萄糖后1 h血糖(OGTT-1h)≥10.0 mmol/L,2 h后血糖(OGTT-2h)≥8.5 mmol/L。排除標準:孕前糖尿病;雙胎或多胎妊娠;合并嚴重肝腎、心腦血管疾病及各種形式的感染和應激等狀態。另選擇同期健康的40例孕婦作為對照組。

本研究經中國人民解放軍總醫院第六醫學中心倫理委員會批準,所有入組孕婦均簽署了知情同意書。

二、研究方法

1.臨床生化指標檢測:兩組患者均抽取空腹外周靜脈血5 ml,采用酶偶聯比色法測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(OGTT-1h)、餐后2 h血糖(OGTT-2h)采用葡萄糖氧化酶法測定。糖化血紅蛋白(HbA1c)使用親和層析高效液相法測定。空腹胰島素(FINS)使用化學發光免疫分析測定。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FINS(μU/ml)×FPG(mmol/L)/22.5;胰島β細胞分泌指數(HOMA-β)=20×FINS(μU/ml)/(FPG(mmol/L)-3.5)。

2.外周血NK細胞測定:禁食至少8 h后,抽取外周靜脈血5 ml。聚蔗糖分離單核細胞,磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌兩次,室溫下用相應的單克隆抗體(CD3-PerCP,Miltenyi,德國;Hu CD56 BV510 NCAM16.2,BD PMG,美國)對NK細胞進行標記,避光培養1 h,然后PBS洗滌細胞兩次,所有樣本中加入2 ml紅細胞裂解液輕搖混勻后孵育10 min。將裂解后的樣本15 000 rpm離心5 min,收集上清液后再用PBS進行兩次清洗。最后將收集的上清液上機,使用流式細胞儀(DxFLEX型,Beckmancoulter公司,美國)進行免疫熒光和多色流式細胞術分析檢測NK細胞亞型表面標志物的活性,以及外周血細胞因子白細胞介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、穿孔素和顆粒酶B的水平。

三、統計學分析

結 果

一、兩組孕婦的一般臨床資料

GDM組孕婦平均年齡(32.43±3.03)歲,平均孕周(39.01±1.35)周;對照組孕婦平均年齡(31.17±3.78)歲,平均孕周(39.21±1.14)周。兩組孕婦的年齡、孕周、體質量指數(BMI)及TC、TG、HDL-C、LDL-C、HOMA-β水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05);兩組孕婦間HbA1c、FINS、FPG、OGTT-1 h、OGTT-2 h、HOMA-IR相比,差異均具有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 一般臨床資料比較(-±s)

二、兩組孕婦NK細胞占比及各亞群分布

根據人類NK細胞CD56分子表達密度不同,將NK細胞分為CD3-CD56brightNK細胞、CD3-CD56dimNK細胞。與對照組相比,GDM組外周血中NK細胞占比、CD3-CD56dimNK細胞亞群占比顯著升高(P<0.05);而CD3-CD56brightNK細胞亞群在兩組中分布無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組孕婦NK細胞占比及各亞群分布比較(-±s)

三、兩組孕婦NK細胞相關促炎因子變化

NK細胞主要通過分泌相關細胞因子參與體內炎癥及免疫調節。經過Mann-WhitneyU檢驗,與對照組相比,GDM組IFN-γ和穿孔素水平顯著升高(P<0.05);兩組孕婦的IL-10、TNF-α、GM-CSF及顆粒酶B比較均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組孕婦血清細胞因子水平比較[M(P25,P75)]

四、FINS、HOMA-IR與NK細胞相關促炎因子水平的相關性

Spearman相關分析顯示,IFN-γ水平與FINS(r=0.280)、HOMA-IR(r=0.252)均呈正相關(P<0.05);穿孔素水平與HOMA-IR(r=0.311)呈正相關(P<0.05);FINS、HOMA-IR水平與IL-10、TNF、GM-CSF、顆粒酶B之間無顯著相關性(P>0.05)(表4)。

表4 FINS、HOMA-IR與相關促炎因子水平的相關性

討 論

GDM主要的特點是妊娠期間出現的血糖升高,在分娩后的一段時間內可恢復至正常。有研究表明,與妊娠期糖耐量正常的孕婦相比,GDM患者在未來患有2型糖尿病的風險將會更高[7-8]。盡管目前很多學者針對GDM進行了許多研究,但其發病機制仍不清楚。近年來,有研究發現,固有免疫反應與肥胖、2型糖尿病和GDM等代謝性疾病的發生發展密切相關[9]。

NK細胞作為固有免疫反應的重要成員,不僅能夠通過多種機制參與機體的免疫防御,還介導和參與機體系統性炎癥反應。在糖尿病患者中,外周血中的NK細胞主要發揮免疫調節作用,NK細胞不僅可以殺傷胰島細胞,而且在糖尿病的發生發展中起著重要作用[10-11]。在1型糖尿病的早期階段,NK細胞的活性就已經發生了改變[12]。2型糖尿病和糖耐量減低患者的NK細胞活性也明顯低于正常對照組[13-14]。然而,關于NK細胞與妊娠期糖尿病關系的研究較少,結論也尚不統一。因此,我們在前人報道的基礎上,首先對GDM患者外周血中NK細胞及其亞群的變化進行了研究。本研究發現,GDM組中NK細胞的占比要顯著高于正常妊娠婦女,說明NK細胞可能參與了GDM的發生與發展。

人類NK細胞的分類主要是根據其表達CD56分子的密度差異來劃分的,目前主要分為兩個亞型,以細胞毒作用為主的CD3-CD56dimNK細胞和以分泌為主的CD3-CD56brightNK細胞。近期,有研究發現,CD56dimNK細胞相比于CD56brightNK細胞能夠表達更多的穿孔素,并能在激活后的早期產生更多的細胞因子IFN-γ[15]。在本研究中,我們同樣發現,GDM組中外周血CD3-CD56dimNK細胞亞群占比要顯著多于對照組,這與Chiba等[16]的結論相一致。這表明GDM患者的NK細胞毒性和分泌作用可能增強。有文獻曾報道,外周血中NK細胞的數量和活性與氧化應激反應及各種炎癥因子的產生密切相關[17]。GDM患者處于一種慢性炎癥反應狀態,炎癥反應過程中釋放的炎癥因子和體內高糖引起的氧化應激反應過程中產生的活性氧簇等產物可能損傷NK細胞,繼而影響NK細胞的活化。因此,本研究結果提示,NK細胞毒性增強和促炎因子分泌增加可能在GDM發生發展的病理生理過程中發揮一定作用。

本研究結果發現,FINS和HOMA-IR是妊娠期糖尿病發生的危險因素。FINS的水平反映了胰島細胞的儲存和分泌功能,其升高反映了孕婦的代償需求。既往研究表明,妊娠早期的FINS可以作為GDM的預測指標之一[18]。HOMA-IR是一種評估胰島素抵抗的簡單方法。有研究發現,妊娠早期GDM組HOMA-IR水平顯著高于正常對照組,提示妊娠早期GDM孕婦存在胰島素抵抗[19]。本研究同樣發現,GDM組中FINS和HOMA-IR水平均顯著高于對照組,這與上述研究結果相一致。

IFN-γ是一種T淋巴細胞和NK細胞表達的促炎因子,可激活巨噬細胞,引起體內炎癥。以往的研究發現,IFN-γ可能參與了糖尿病的發生發展[20]。Hara等[21]的研究發現,妊娠期糖尿病和2型糖尿病患者外周血和臍帶血中的IFN-γ水平明顯高于正常孕婦。本實驗結果同樣發現,GDM組中血漿IFN-γ水平較對照組顯著增高。我們進一步通過相關性分析發現,IFN-γ水平與FINS、HOMA-IR水平均呈正相關。可能的機制是IFN-γ對巨噬細胞的激活增強,而功能失調的巨噬細胞的浸潤、促炎細胞因子的暴露和免疫細胞產生的活性氧/氮的釋放導致胰腺β細胞的功能障礙和胰島素抵抗的增加。此外,我們同樣發現,穿孔素水平與HOMA-IR水平呈正相關。穿孔素是一種細胞毒效應分子,主要由NK細胞和CD8+T細胞釋放,與顆粒酶B一起介導靶細胞的死亡途徑[22]。淋巴細胞釋放穿孔素是1型糖尿病患者胰腺β細胞破壞的主要作用機制[23]。本研究結果顯示,GDM組外周血中穿孔素水平明顯升高。前期有研究發現,在肥胖相關的胰島素抵抗過程中,穿孔素可以調節炎癥反應。因此,穿孔素水平的升高不僅表明NK細胞毒性增強,也反映了機體的炎癥狀態。雖然目前沒有明確的證據表明NK細胞的毒性作用會直接損害胰島β細胞,但慢性炎癥可導致胰島素抵抗增加,從而導致GDM的發生。

綜上所述,GDM患者外周血中的NK細胞數量增加、活性增強,其所分泌的IFN-γ和穿孔素水平呈高表達樣,且與胰島素抵抗的發生具有密切聯系,進而影響妊娠期糖尿病的發生。因此,GDM的免疫功能紊亂可能是GDM發病和發展的潛在原因,而了解NK細胞的功能變化與其引起和維持的慢性炎癥之間的關系,將為未來GDM的治療提供新的策略。然而,本研究納入的人群僅為在中國人民解放軍總醫院第六醫學中心產前檢查的孕婦,可能缺乏人群代表性;其次,本研究樣本量較小,今后尚需進一步擴大樣本量來補充完善本研究得出的結果,以期通過對固有免疫領域的深入研究來理解GDM的發病及發展機制,從而對拓展預防和治療GDM提供新的思路。