基于2T2D相關譜技術分析玉米自交系親緣關系

劉 洋, 楊仁杰, 劉海學

(天津農學院, 天津 300392)

我國是糧食生產大國,種業是國家戰略性、基礎性的核心產業,是促進農業長期穩定發展、保障國家糧食安全的根本。玉米是我國重要的糧食和飼料作物之一,2012年已經成為我國產量第一的糧食作物[1]。玉米產量提高主要依靠新品種的選育與推廣,而優良自交系的選育是玉米利用雜種優勢的前提,種質資源是玉米育種工作者進行玉米新品種選育的基礎[2]。20世紀80年代后期,隨著生活水平的提高,對農作物品質的要求越來越高,加強品質育種成為當前農作物研究的主要內容[3]。目前的玉米育種多采用系譜法來選擇優良世代和雜交優勢強的父母本,耗時長,且極易受到環境條件的影響。由于傳統育種方法選擇不定向,導致收集種子等的工程量浩大,浪費人力物力資源[4]。因此,發展一種能夠大批量、實時、快速且能在早期鑒別出玉米自交系親緣關系用于玉米育種的分析方法非常必要。

光譜分析技術是一種高效、快速的現代分析技術,它綜合運用了計算機、光譜學和化學計量學等多個學科的最新研究成果,并以其非破壞性、無需樣品預處理、速度快、成本低等特點在農業中被廣泛應用[5-10]。美國Du Pont公司利用近紅外光譜技術進行油用玉米品種的篩選,Dyer指出:“利用近紅外單粒分析,可以在育種周期中節省一個世代”[11]。2T2D(Two-trace two-dimensional)相關譜是在廣義二維相關譜基礎上發展起來的兩譜相關譜技術,該技術將實驗設計和數據處理相結合,可有效提取復雜生物體系中微弱變化的特征信息,特別適合相似樣品的判別分析[12-18]。目前,未見基于2T2D相關譜技術來分析玉米自交系親緣關系的相關報道。本研究借助近紅外、中紅外光譜儀,通過對不同玉米自交系的近/中紅外光譜、同譜2T2D近/中紅外相關譜和異譜2T2D近-中紅外相關譜進行分析,以期為玉米自交系親緣關系的鑒別及分類提供一種新的視角。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用材料為本實驗室保存的3個玉米自交系,分別命名為樣品1、樣品2、樣品3。取等量玉米樣品粉碎、過80目篩,裝袋,備測。

1.2 實驗儀器

美國PerkinElmer公司的Spectrum GX傅里葉變換近紅外光譜儀和中紅外光譜儀。近紅外采用積分球附件,掃描范圍4 000～9 000 cm-1,分辨率4 cm-1;中紅外采用衰減全反射(ATR)附件,掃描范圍650～3 000 cm-1,分辨率4 cm-1。采用高速萬能粉碎機(FW100)對樣品進行粉碎。

1.3 實驗方法

近紅外光譜掃描:首先將準備好的待測樣品盛于直徑10 mm的指形樣品杯中,并壓實,接著將樣品杯放入旋轉樣品臺進行近紅外漫反射光譜測試。

中紅外光譜掃描:將準備好的待測樣品盛于ATR晶體ZnSe表面,并通過壓板壓實,使其緊貼在晶體表面,然后進行中紅外衰減全反射光譜測試。

1.4 分析方法

所采集的3個玉米自交系的近紅外光譜和中紅外光譜,根據研究目標選擇樣品光譜,形成近紅外光譜矩陣A和中紅外光譜矩陣B:

其中,Si(v)和Sj(v)分別是第i和j個樣品的近紅外或中紅外光譜,i=1,2,3;j=1,2,3;i≠j。

根據Noda[12]理論,第i和j個樣品在波數為v1和v2處異譜2T2D近-中紅外相關譜Ф(v1,v2)可通過公式計算獲得:

式中,k為相關分析的光譜數,本研究中k=2,T表示轉置。

如果B=A,根據公式可得第i和j個樣品的同譜2T2D近紅外相關譜;若A=B,即可得第i和j個樣品的同譜2T2D中紅外相關譜。

2T2D相關譜技術可以提供兩個不同樣本(一個參考樣本,另一個為待分析樣本)來源吸收峰之間豐富的、有價值的相關信息,對待分析樣本與參考樣本之間的差異信息具有高的靈敏度[12-14]。本研究主要利用該技術來提取并分析兩個不同玉米自交系之間的差異光譜信息,實現其親緣關系的鑒別。

采用Origin2018軟件完成一維光譜圖繪制,課題組編寫的二維相關MATLAB代碼實現2T2D相關譜和自相關譜的計算及圖譜繪制。

2 結果與分析

2.1 不同玉米自交系的近紅外光譜

圖1 3種玉米自交系的近紅外漫反射光譜Fig.1 Near-infrared diffuse reflectance spectra of three maize inbred lines

2.2 不同玉米自交系的中紅外光譜

圖2為3種玉米自交系在650～3 000 cm-1范圍的中紅外衰減全反射光譜。由圖2可知,在848 cm-1、1 008 cm-1、1 144 cm-1、1 344 cm-1、1 644 cm-1、1 744 cm-1、2 852 cm-1和2 924 cm-1處均存在特征峰,特征峰對應的主要化學成分是烴類化合物、酚類、醇類、醚類、芳香族類和脂肪酸等。與近紅外光譜相比,3種玉米自交系在中紅外波段吸光度存在較大差異。

圖2 3種玉米自交系的中紅外衰減全反射光譜Fig.2 Mid-infrared attenuated total reflectance spectra of three maize inbred lines

2.3 不同玉米自交系間2T2D近紅外相關譜

相對于常規的一維光譜,2T2D相關譜技術具有高的光譜分辨率,可提供研究體系隨外擾變化的光譜信息。本實驗以不同玉米自交系為外擾,對其進行2T2D相關譜計算,根據相關峰強度實現兩個玉米自交系親緣關系的判別。兩個樣品越相似,其相關強度越小,如果兩個樣品完全相同,理論上其在任何波數處相關強度應為0;反之,兩個樣品差異性越大,其相關強度越大。

圖3～圖5分別是3個樣品之間的2T2D近紅外相關譜和對應的自相關譜。樣品1與樣品2相關強度的范圍為0～4.2×10-4,樣品1與樣品3相關強度范圍為-2.0×10-5～1.8×10-5,樣品2與樣品3相關強度范圍為0～5.5×10-4。根據相關強度可推斷,樣品1與樣品3較相似,親緣關系較近;樣品1與樣品2、樣品3與樣品2存在差異,親緣關系較遠。

圖3 樣品1與樣品2的2T2D近紅外相關譜(A)和自相關譜(B)Fig.3 2T2D near infrared (NIR) correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 2

圖4 樣品1與樣品3的2T2D近紅外相關譜(A)和自相關譜(B)Fig.4 2T2D NIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 3

圖5 樣品2與樣品3的2T2D近紅外相關譜(A)和自相關譜(B)Fig.5 2T2D NIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 2 and sample 3

2.4 不同玉米自交系間2T2D中紅外相關譜

圖6～圖8分別是3個樣品之間的2T2D中紅外相關譜和對應的自相關譜。可觀察到,樣品1與樣品2的相關強度比樣品1與樣品3的相關強度高1個數量級;樣品2與樣品3的相關強度比樣品2與樣品1的相關強度高1個數量級;樣品3與樣品2的相關強度比樣品3與樣品1的相關強度高2個數量級。從上述分析可推斷,樣品1和樣品3較相似,親緣關系較近;樣品2與樣品3存在較大差異,親緣關系較遠。

圖6 樣品1與樣品2的2T2D中紅外相關譜(A)和自相關譜(B)Fig.6 2T2D mid-infrared (MIR) correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 2

圖7 樣品1與樣品3的2T2D中紅外相關譜(A)和自相關譜(B)Fig.7 2T2D MIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 3

圖8 樣品2與樣品3的2T2D中紅外相關譜(A)和自相關譜(B)Fig.8 2T2D MIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 2 and sample 3

2.5 不同玉米自交系間異譜2T2D近-中紅外相關譜

為進一步說明方法的有效性,對3個玉米樣品進行異譜2T2D近-中紅外相關分析(圖9～圖11),相關強度的關系為:樣品2與樣品3>樣品1與樣品2>樣品1與樣品3。證明樣品1與樣品3為相近的玉米自交系,親緣關系較近;樣品2和樣品3存在較大差異,親緣關系較遠。

圖9 樣品1與樣品2的異譜2T2D近-中紅外相關譜Fig.9 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 1 and sample 2

圖10 樣品1與樣品3的異譜2T2D近-中紅外相關譜Fig.10 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 1 and sample 3

圖11 樣品2與樣品3的異譜2T2D近-中紅外相關譜Fig.11 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 2 and sample 3

3 結論與展望

本研究從近/中紅外光譜、同譜2T2D近/中紅外相關譜以及異譜2T2D近-中紅外相關譜入手,對玉米自交系親緣關系進行初步分析。結果表明,近紅外光譜3個樣品光譜輪廓相似,僅在吸光度存在差異,而中紅外光譜與近紅外光譜相比,3個玉米自交系在中紅外波段吸光度存在較大差異。從樣品之間的同譜和異譜2T2D相關強度都可以推斷,玉米自交系樣品1與樣品3較相似,親緣關系較近;樣品2與樣品3存在較大差異,親緣關系較遠。研究結果表明,基于2T2D相關譜技術來確定玉米自交系的親緣關系是可行的,該技術可能成為種子快速可靠的預篩選方法。

下一步繼續將2T2D相關譜技術與統計學、化學計量學相結合,提取與種子參數相關的特征光譜信息,實現對其他玉米自交系的親緣關系進一步鑒別,并補充和完善上述鑒別方法,以進一步驗證所建立方法的可行性和準確性。同時,該方法也可推廣應用到其他作物上,如小麥、水稻、大豆等,為其他作物的育種提供參考方式。