circERBB2在卵巢癌中的表達及作用機制研究

趙 達, 包利利, 李 波, 俞 巖, 王曉黎

(1. 海南醫學院, 海南 海口, 570216; 2. 海南省婦女兒童醫學中心 婦科, 海南 海口, 570100)

卵巢癌是臨床常見的婦科腫瘤,也是婦科腫瘤相關死亡的5大原因之一[1-2]。早期診斷并治療可提高卵巢癌患者的生存率,故臨床亟需探尋新的診斷與治療靶點,以改善卵巢癌患者的預后。環狀RNA(circRNA)是一種呈封閉環狀結構的RNA分子,不受RNA外切酶影響,表達穩定,不易降解[3]。研究[4]表明,由癌癥相關染色體易位產生的融合circRNA與腫瘤發生和治療耐藥性有關。微小RNA(miRNAs)是長度為19～22個核苷酸的短鏈RNA,其作為許多細胞過程的負調節因子,在癌癥、糖尿病、肥胖癥和心血管疾病等疾病中大量異常表達[5]。miRNAs通過與信使RNA(mRNA)3′UTR的特定位點結合,調節動物30%的基因,導致轉錄后抑制[6]。miRNAs在細胞增殖、分化、凋亡等方面的作用已得到證實,且其在發育中也發揮作用[7]。研究[8]發現,微小RNA-187-3p(miR-187-3p)在肺癌、腎細胞癌、前列腺癌、結直腸癌中表達下調,提示miR-187-3p在人類癌癥中具有抑瘤作用。原癌基因BCL6是轉錄主調節因子,在分子水平上能夠抑制TP53、CDKN1A和ATR等DNA損傷反應基因,以促進與轉型重組和體細胞高突變相關的基因組對不穩定性的耐受性。目前,BCL6在卵巢癌中的作用及其與circERBB2和miR-187-3p的關系尚未明確。本研究基于臨床樣本分析和體內外實驗等探討circERBB2在卵巢癌中的表達情況及作用機制,以期為卵巢癌的預防及靶向治療提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選取2021年6月—2022年12月海南省婦女兒童醫學中心收治的20例卵巢癌患者的卵巢癌組織和癌旁正常組織作為研究樣本,患者均經病理檢查和細胞學檢查確診卵巢癌。20例患者中,年齡≤55歲4例, >55歲16例; 腫瘤直徑≤3 cm者13例, >3 cm者7例; 國際婦產科聯盟(FIGO)分期Ⅰ～Ⅱ期者14例,Ⅲ～Ⅳ期者6例。本研究方案獲得海南省婦女兒童醫學中心倫理委員會審核批準,且所有患者簽署知情同意書。

1.2 細胞培養方法

人正常卵巢細胞系HOSEpiC和人卵巢癌細胞系OVCAR-3、SKOV-3、3AO、OV90均購自北納生物細胞公司。在含10%胎牛血清(FBS, 美國Hyclone公司)的90% RPMI-1640培養基中培養HOSEpiC、3AO細胞; 在含20%FBS的90% RPMI-1640培養基中培養OVCAR-3細胞; 在含10%FBS的90% DMEM培養基中培養SKOV-3、OV90細胞。所有細胞均放置于37 ℃、5%CO2環境中培養。

1.3 GEO數據庫分析

應用findcirc和circfinder工具分析來自GEO數據庫的高通量數據(GSE79572數據集)。以P<0.05和倍數變化值>2.0篩選卵巢癌中差異表達的circRNA, 以P<0.05和倍數變化值>1.0篩選差異表達的miRNA。基于Targetscan 7.1軟件和韋恩圖,篩選GSE79572數據集中差異表達基因與預測所得miRNA靶向基因的交叉基因。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

使用TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司)和PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司)提取總RNA, 使用SYBRGreenI試劑盒(日本Takara公司)和LightCycler2.0試劑盒(瑞士Roche公司)進行qRT-PCR, 內參基因分別為U6和GAPDH, 引物序列見表1, 采用2-△△Ct法分析基因相對表達量。

表1 引物序列

1.5 細胞轉染與分組

pcDNA3.1 hsa_circ_0007766(circERBB2)、miR-187-3p模擬物、miR-187-3p抑制劑和陰性對照(NC)載體(中國GenePharma公司),si-circERBB2-1、si-circERBB2-2和si-BCL6(美國Invitrogen公司), si-BCL6、miR-187-3p模擬物和miR-187-3p抑制劑序列見表2。將細胞按不同轉染方法進行分組,分別為對照組(轉染NC)、si-circ 1組(轉染si-circERBB2-1)、si-circ 2組(轉染si-circERBB2-2)、模擬物組(轉染miR-187-3p模擬物)、si-BCL6組(轉染si-BCL6)、抑制劑組(轉染miR-187-3p抑制劑)、si-circ+抑制劑組(轉染si-circERBB2-1+miR-187-3p抑制劑)、抑制劑+si-BCL6組(轉染miR-187-3p抑制劑+si-BCL6)、p-circ組(轉染pcDNA3.1 circERBB),根據轉染試劑Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)操作說明書進行轉染。培養24 h后,檢測各組細胞的轉染效率。

表2 BCL6 siRNA、miR-187-3p模擬物及抑制劑序列

1.6 核糖核酸酶R(RNase R)消化試驗

使用circERBB2和GAPDH在20 μL反應緩沖液中于37 ℃環境進行RNase R消化反應45 min。通過乙醇沉淀法除去酶和鹽,重復消化和沉淀反應2次。通過2.0% TAE-Agarose凝膠電泳或2100生物分析儀(Aglient)對已處理RNA樣品進行分析,并與未處理RNase R樣品進行比較。所有實驗重復3次。

1.7 RNA下拉實驗

使用生物素RNA標記混合物(瑞士Roche公司)對circERBB2-野生型(circ-Probe組)和對照組(con-Probe組)探針進行體外轉錄和生物素標記,用不含RNase的DNase I(瑞士Roche公司)處理(Input組)并使用RNeasy Mini試劑盒(美國Qiagen公司)進行RNA下拉實驗。將細胞蛋白提取物(1 mg)與生物素化RNA生物素標記的RNA(50 pmol)混合,用鏈霉親和素瓊脂糖珠(美國Invitrogen公司)孵育,用室溫NaCl/碘化丙啶(PI)洗滌3次。將樣品離心后,提取RNA上清液,進行qRT-PCR實驗,檢測circERBB2和miR-187-3p水平。所有實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

將野生型BCL6(BCL6-WT)、突變型BCL6(BCL6-MUT)、miR-187-3p模擬物和模擬物對照3′UTR插入pGL3載體(美國Promega公司)合成熒光素酶報告基因載體的相關結合位點。將293T細胞培養于24孔板,再將miR-187-3p模擬物(miR-對照組)、模擬物對照(miR-模擬物組)和BCL6-WT或BCL6-MUT共同轉染至293T細胞,通過Lipofectamine3000(美國Life公司)于轉染后48 h測定熒光素酶活性。所有實驗重復3次。

1.9 細胞活力檢測

采用噻唑藍(MTT)法測定轉染后48 h的細胞增殖水平,每個孔用含100.0 μL新鮮0.5 g/L MTT的無血清培養基代替轉染培養基。37 ℃孵育4 h后,吸除MTT培養基,并向每孔加入50.0 μL二甲亞砜(DMSO), 37 ℃孵育10 min, 用分光光度儀檢測455 nm處吸光度。所有實驗重復3次。

1.10 細胞周期檢測

在細胞周期實驗中,轉染后72 h收集不同的細胞群進行消化,得到細胞懸液。將細胞懸液離心,棄上清液,剩余細胞用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,用75%乙醇固定4 h。將固定好的細胞離心,再用PBS洗滌3次。向固定的細胞中加入40 μg PI和1 mL RNase染色液(美國BD生物科學),于避光區室溫孵育15 min。染色后,使用FACS Calibur(美國BD公司)檢測細胞周期,并使用FACS Diva(美國BD公司)分析數據。所有實驗重復3次。

1.11 細胞劃痕實驗

采用傷口愈合實驗評價人卵巢OVCAR-3細胞活力。將細胞置于含無血清培養基的6孔板中,達到80%～90%的融合度,用200 μL微量移液管進行劃痕處理。使用顯微鏡對不同時點劃痕愈合情況進行拍照檢測。所有實驗重復3次。

1.12 Transwell侵襲實驗

將100 μL Tritrigel(美國BD Bioscience公司)和400 μL無血清培養基充分混合,置于Transwell腔室(美國Corning公司)中(40 μL/室)。將無血清培養基中0.5×106～2.5×106個細胞放入上腔室(每個腔室200 μL),同時將含20%FBS的培養基添加至下腔室。培養24～48 h后,用4%多聚甲醛固定細胞, 0.1%結晶紫染色。對每個小孔進行拍照,統計5～10個獨立區域,計算統計平均值。所有實驗重復3次。

1.13 統計學分析

2 結 果

2.1 circERBB2、miR-187-3p與BCL6的關系

本研究對GSE79572數據集進行findcirc和circfinder分析發現,卵巢癌中僅有1種共同的差異表達circRNA呈高表達,即circERBB2, 見圖1A; 基于TargetScan Human 7.1發現circERBB2靶向的miRNA,即miR-187-3p, 見圖1B; 從TargetScan 7.1中獲得GSE79572數據集差異表達基因與預測所得miR-187-3p靶向基因,韋恩圖取交集后得到7個交叉基因,見圖1C、圖1D; 從TargetScan數據庫獲取circERBB2與miR-187-3p之間、miR-187-3p與BCL6之間的潛在結合位點,見圖1E。

A: 對GSE79572數據集進行findcirc和circfinder分析,卵巢癌中僅1種共同的差異表達circRNA(circERBB2)呈高表達;B: TargetScan Human 7.1分析發現靶標miRNA(miR-187-3p); C: GSE79572數據集中差異表達基因與預測所得miR-187-3p靶向基因的韋恩圖; D: 7個交叉基因列表; E: circERBB2與miR-187-3p、miR-187-3p與BCL6的潛在結合位點。

2.2 circERBB2、miR-187-3p、BCL6在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達情況

卵巢癌組織中circERBB2、BCL6表達水平高于癌旁組織, miR-187-3p表達水平低于癌旁組織,差異有統計學意義(P<0.05), 見表3。卵巢癌細胞系OVCAR-3、SKOV-3、3AO、OV90中circERBB2表達水平均高于正常卵巢細胞系HOSEpiC,差異有統計學意義(P<0.05), 見表4。因OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞 circERBB2表達量高,本研究選用OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞進行后續實驗。

表3 circERBB2、miR-187-3p、BCL6在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達情況比較

表4 circERBB2在不同細胞系中的表達情況比較

2.3 circERBB2與miR-187-3p、miR-187-3p與BCL6的靶向關系

RNA下拉實驗結果顯示,con-Probe組、circ-Probe組circERBB2、miR-187-3p表達水平均低于Input組,差異有統計學意義(P<0.05), 見表5。

表5 RIP下拉實驗驗證circERBB2和miR-187-3p的表達情況

OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞中, p-circ組circERBB2表達水平均高于對照組, miR-187-3p表達水平均低于對照組, si-circ 1組、si-circ 2組circERBB2表達水平均低于對照組,miR-187-3p表達水平均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 表明上調circERBB2可以上調OVCAR-3、SKOV-3細胞系中circERBB2表達并下調miR-187-3p表達,沉默circERBB2可以下調OVCAR-3、SKOV-3細胞系中circERBB2表達并上調miR-187-3p表達,見表6。

表6 各組circERRBB2、miR-187-3p表達情況比較

miR-模擬物組BCL6-WT熒光素酶活性低于BCL6-MUT, 差異有統計學意義(P<0.05), 表明miR-187-3p顯著抑制了BCL6-WT的熒光素酶活性,但未抑制BCL6-MUT的熒光素酶活性,見表7。

表7 各組熒光素酶活性比較

OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞中,模擬物組miR-187-3p表達水平高于對照組,BCL6表達水平低于對照組,抑制劑組miR-187-3p表達水平低于對照組,BCL6表達水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 表明miR-187-3p模擬物和抑制劑可調節miR-187-3p和BCL6表達水平,見表8。

表8 miR-187-3p模擬物和抑制劑對細胞miR-187-3p、BCL6表達的影響

OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞中, p-circ組BCL6表達水平高于對照組, si-circ 1組、si-circ 2組BCL6表達水平低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),表明過表達circERBB2可顯著上調BCL6表達,沉默circERBB2可顯著下調BCL6表達,見表9。

表9 過表達和沉默circERBB2對BCL6表達的影響

2.4 抑制circERBB2、過表達miR-187-3p、抑制BCL6對卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和細胞周期的影響

OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞中, si-circ組、模擬物組、si-BCL6組G0/G1期細胞占比均高于對照組,S期細胞占比均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05); SKOV-3細胞中,si-circ組、模擬物組、si-BCL6組G2/M期細胞占比低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), 見表10。由此表明,抑制circERBB2、過表達miR-187-3p和抑制BCL6均能夠抑制卵巢癌細胞增殖。細胞周期實驗結果證實, si-circERBB2、miR-187-3p模擬物和si-BCL6阻斷了G1期細胞周期,見圖2。

表10 各組細胞周期情況 %

劃痕實驗結果顯示, OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞中, si-circ組、模擬物組、si-BCL6組的劃痕愈合率均低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), si-circ+抑制劑組、抑制劑+si-BCL6組的劃痕愈合率與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05), 表明si-circERBB2、miR-187-3p模擬物和si-BCL6可削弱OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞遷移能力,而miR-187-3p抑制劑可恢復由si-circERBB2和si-BCL6引起的細胞遷移能力下降,見表11、圖3A。

表11 各組OVCAR-3細胞和SKOV-3細胞的劃痕愈合率比較 %

Transwell侵襲實驗結果顯示, OVCAR-3細胞、SKOV-3細胞中, si-circ組、模擬物組、si-BCL6組的侵襲細胞數量均少于對照組,差異有統計學意義(P<0.05), si-circ+抑制劑組、抑制劑+si-BCL6組的侵襲細胞數量與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05), 表明si-circERBB2、miR-187-3p模擬物和si-BCL6可顯著降低卵巢癌細胞的侵襲能力,抑制miR-187-3p則可恢復由si-circERBB2和si-BCL6引起的細胞侵襲能力降低,見表12、圖3B。

表12 各組OVCAR-3細胞和SKOV-3細胞的侵襲細胞數量比較 個

3 討 論

卵巢癌是一種多亞型的異質性疾病,其中90%為上皮性腫瘤,間質細胞腫瘤和生殖細胞腫瘤則僅占少數[9-10]。上皮性卵巢癌是最致命的女性生殖系統惡性腫瘤,早期診斷可提高患者的生存率[11-12]。研究[13]表明, circRNA對細胞凋亡、細胞增殖、癌癥發生和發育、衰老等過程具有重要的調控作用。在健康組織和病變組織的大多數細胞過程中,一些circRNA能夠通過競爭性吸附miRNA而發揮作用[14-15]。本研究基于數據庫分析在卵巢癌中發現circERBB2、BCL6和miR-187-3p,并驗證了三者間存在的靶向關系,進一步開展各項實驗發現, circERBB2可通過靶向miR-187-3p吸附,促進原癌基因BCL6表達,調控卵巢癌的發展。

圖2 各處理組流式細胞術檢測細胞周期結果

本研究結果顯示, circERBB2在卵巢癌中表達較高,且其能通過靶向miR-187-3p發揮調控腫瘤進程的作用。circRNA廣泛存在于哺乳動物細胞中,通過吸附miRNA或與其他分子相互作用,在轉錄時或轉錄后調節基因表達水平[16]。本研究還發現, circERBB2與miR-187-3p之間,miR-187-3p與BCL6之間存在潛在結合位點。本研究發現, circERBB2和BCL6在卵巢癌細胞系中的表達水平較高, miR-187-3p在卵巢癌細胞系中的表達水平較低。既往研究[17]發現,長鏈非編碼RNA(lncRNA)和circRNA的生物學功能機制使其更傾向于作為上游調節物質調節miRNA表達,進而調控下游基因發揮作用。

本研究發現, circERBB2與miR-187-3p具有靶向關系,且p-circERBB2可以上調circERBB2表達、下調miR-187-3p表達,此外miR-187-3p對BCL6-WT 3′UTR的熒光素酶活性有顯著抑制作用,但對BCL6-MUT的熒光素酶活性無顯著抑制作用。miRNA主要通過阻斷靶基因表達而介導其在動物細胞中的生物學功能,本研究搜索不同數據庫后發現miR-187-3p的預測靶標基因是BCL6[18]。本研究還發現, miR-187-3p模擬物和抑制劑可調節miR-187-3p和BCL6表達,而過表達circERBB2可顯著上調BCL6表達。由于復雜的結構重排,BCL6基因與盲肌樣蛋白1(MBNL1)融合[19]。BCL6在免疫反應中起著重要作用,是炎癥的負性調節因子。本研究結果顯示, si-circERBB2、miR-187-3p模擬物和si-BCL6可抑制細胞增殖,阻滯G1期細胞周期,抑制細胞遷移能力和侵襲能力。研究[18]顯示,肺癌細胞株A549和SPC-A-1中miR-187-3p能夠明顯抑制細胞增殖及轉移進程。此外, miR-187-3p的生長抑制作用除了抑制細胞增殖外,還有誘導細胞凋亡。

A: 各處理組OVCAR-3和SKOV-3細胞劃痕實驗結果; B: 各處理組OVCAR-3和SKOV-3細胞Transwell侵襲實驗結果。圖3 OVCAR-3、SKOV-3細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結果

本研究通過細胞實驗對circERBB2、BCL6、miR-187-3p三者的調控關系進行初步分析,但仍存在一定局限性,例如僅探討了circERBB2通過靶向吸附miR-187-3p促進原癌基因BCL6表達進而調節卵巢癌過程,對circBBB2產生這種效應的特殊機制則未深入研究,未來還需進一步深入探討。

綜上所述,本研究基于臨床樣本分析、細胞實驗等發現circERBB2能夠通過靶向吸附miR-187-3p促進原癌基因BCL6表達,從而調控卵巢癌過程,這為未來早期診斷標志物的提出及卵巢癌的靶向治療等提供了一定參考依據。