妊娠期糖尿病患者血清NLRP3炎性小體信號通路的臨床研究

何 苗, 曹 羽, 王 佳, 陳 璐, 苗春菊

(蘇州大學附屬常熟醫(yī)院 產(chǎn)科, 江蘇 常熟, 215500)

妊娠期糖尿病(GDM)是妊娠期常見的糖代謝異常,全球發(fā)生率約為18%[1], 中國發(fā)病率為5%～10%[2]。GDM發(fā)病率呈逐年上升趨勢,儼然成為世界范圍內(nèi)重要且日益升級的健康問題。GDM不僅增加胎兒畸形、羊水過少、羊水過多、胎兒發(fā)育遲緩、巨大兒、肩難產(chǎn)、臂叢神經(jīng)損傷、新生兒呼吸窘迫綜合征、死胎、死產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風險,同時增加母體妊娠期高血壓性疾病、難產(chǎn)、手術(shù)產(chǎn)、產(chǎn)時及產(chǎn)后出血及產(chǎn)后2型糖尿病的發(fā)生風險。因此,探索GDM的發(fā)病機制及尋找有效的防治方法是臨床亟待解決的問題。目前研究發(fā)現(xiàn), GDM的發(fā)生與機體固有免疫系統(tǒng)介導的炎癥反應密切相關(guān)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體活化后在凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)的協(xié)助下募集并活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶-1(Caspase-1), 導致炎性因子白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18)的成熟和分泌,進而介導炎癥性程序性細胞死亡(即細胞焦亡),誘導產(chǎn)生一系列的炎癥反應,與GDM的發(fā)生密切相關(guān)。故本研究探討核苷酸NLRP3炎性小體的細胞焦亡相關(guān)NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-1β/IL-18-TGF-β信號通路在GDM發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象與材料

1.1.1 研究對象: 選取2020年6月—2022年6月在本院產(chǎn)科門診產(chǎn)檢的GDM患者80例為研究對象。其中孕期未予胰島素治療患者60例(未予胰島素治療GDM組),平均年齡為(29.13±5.28)歲,平均孕周為(24.45±2.70)周。孕期予胰島素治療患者20例(胰島素治療GDM組),平均年齡為(30.01±4.86)歲,平均孕周為(24.50±1.15)周。選擇同期健康孕婦30例作為對照組,平均年齡(28.73±5.42)歲,平均孕周為(24.22±1.59)周。各組在年齡、孕周等方面比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0. 05), 具有可比性。本研究已取得所有患者的知情同意,并獲得倫理委員會批準。

納入標準: 根據(jù)人民衛(wèi)生出版社《婦產(chǎn)科學》(第九版)診斷標準,于孕24～28周行75 g葡萄糖耐量試驗(OGTT), 空腹、OGTT 1 h、OGTT 2 h的血糖界值分別為5.1、10.0、8.5 mmol/L, 任何一項達到或超過其相應界值即可診斷為GDM。納入標準: 患者為自然受孕的單胎妊娠,且臨床資料完整。排除標準: 妊娠前糖尿病患者; 感染性疾病、甲狀腺功能亢進等其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病患者; 近期服用糖皮質(zhì)激素以及心、肺、腎等功能障礙患者。

1.1.2 主要儀器及試劑: 北京東勝ETC811 PCR擴增儀、新加坡ABI QuantStudio 5熒光定量PCR測定儀、美國Eppendorf Centrifuge 5418R臺式高速冷凍離心機、Centrifuge 5702R臺式高速離心機、上海天能電泳裝置、Tanon 4600SF凝膠成像系統(tǒng)、杭州奧盛Nanodrop 400A超微量紫外分光光度計、美國Molecular Devices FlexStation 3多功能酶標儀、海門其林貝爾GL-1900恒溫金屬浴、上海一恒DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱。北京達科為生物技術(shù)有限公司: 人淋巴細胞分離液; Takara Bio: PrimeScriptTMRTreagent Kit、RNAiso plus試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒; abcam: Anti-NLRP3 antibody、Anti-ASC antibody、Anti-Caspase-1 antibody; 上海碧云天生物有限公司: Western blot細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液; 上海廣銳生物科技有限公司: IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 資料收集: 收集研究對象年齡、孕周、身高、體質(zhì)量等基礎(chǔ)資料,同時檢測空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生化資料。所有研究對象均禁食8 h以上,抽取20 mL肘靜脈血,取2 mL全血3 000轉(zhuǎn)/mL離心10 min, 留取上清并凍存于-80 ℃冰箱備用,剩余全血經(jīng)人淋巴細胞分離液分離后采用Ficoll-Hypaque密度梯度分離法,嚴格按照試劑盒說明書分離出外周單個核細胞(PBMCs)備用。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(shù)(qRT-PCR): 應用RNAiso plus試劑盒提取人PBMCs總RNA。經(jīng)純度檢測與定量后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再按照RT-PCR試劑說明書及預實驗確定的反應時間與溫度進行實時定量。PCR反應條件為95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 50個循環(huán)。引物序列:NLRP3上游引物為5′-AAAGCCAAGAATCCACAGTGTAAC-3′, 下游引物為5′-TTGCCTCGCAGGTAAAGGT-3′;ASC上游引物為5′-GGATGCTCTGTACGGGAAGG-3′, 下游引物為5′-CGCATCTTGCTTGGGTTG-3′;Caspase-1上游引物為5′-AGGCATGACAATGCTGCTACAA-3′, 下游引物為5′-TGTGCAAATGCCTCCAGCTC-3′;GAPDH上游引物為5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′, 下游引物為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-△△Ct方法分析相對表達量。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot) : 常規(guī)方法提取人PBMCs總蛋白,嚴格按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。含50 ng蛋白質(zhì)的上樣樣品經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上, BSA-TBS室溫封閉1 h, 與一抗稀釋液(NLRP3、ASC、Caspase-1、GAPDH)4 ℃孵育過夜。次日,經(jīng)洗膜緩沖液(TBST)洗滌后,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h。使用Tanon-Chemi成像系統(tǒng)(Tanon-4600SF)掃描蛋白條帶。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA): 應用人IL-1β、IL-18、TGF-β ELISA試劑盒,嚴格按照說明書操作,每個樣本均設(shè)置2個復孔,取均值納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 3組患者基本情況及血脂、血糖水平變化

3組患者年齡、孕周比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); GDM患者(未予胰島素治療GDM組、胰島素治療GDM組)的BMI、FPG、HbA1c、TC、TG高于對照組, HDL-C低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 胰島素治療GDM組的FPG、HbA1c高于未予胰島素治療GDM組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 3組基本情況及血脂、血糖水平變化比較

2.2 3組PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA及其蛋白水平

胰島素治療GDM組(Treated)和未予胰島素治療GDM組(Untreated)的NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達高于對照組(Ctrl),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 胰島素治療GDM組略高于未予胰島素治療GDM組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見圖1。胰島素治療GDM組(Treated)中的NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表達高于未予胰島素治療GDM組(Untreated)和對照組(Ctrl), 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2。

2.3 3組血清中IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化

GDM患者(未予胰島素治療GDM組、胰島素治療GDM組)的血清IL-1β、IL-18、TGF-β高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 胰島素治療GDM組的血清IL-1β、IL-18、TGF-β高于未予胰島素治療GDM組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 3組血清IL-1β、IL-18、TGF-β水平變化比較 ng/L

2.4 3組NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA水平與各變量的Spearman相關(guān)性分析

NLRP3mRNA在對照組、未予胰島素治療GDM組均無相關(guān)性,在胰島素治療GDM組與FPG呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.322(P=0.028);ASCmRNA在對照組無相關(guān)性,在未予胰島素治療GDM組與HbA1c呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.483(P=0.035), 在胰島素治療GDM組與HbA1c、TG呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.512(P=0.026)和0.427(P=0.029);Caspase-1mRNA在對照組與FPG 呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.438(P=0.015), 在未予胰島素治療GDM組與BMI呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.328(P=0.036), 在胰島素治療GDM組與BMI、TC呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.352(P=0.033)和0.487(P=0.017)。

2.5 3組NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白水平與各變量的Spearman相關(guān)性分析

NLRP3在3組均無相關(guān)性; ASC在對照組無相關(guān)性,在未予胰島素治療GDM組與FPG、HbA1c呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.384(P=0.031)和0.463(P=0.027), 在胰島素治療GDM組與FPG、TC、IL-1β、IL-18呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.414(P=0.023)、0.472(P=0.031)、0.493(P=0.029)和0.512(P=0.019)。Caspase-1在對照組與FPG呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.537(P=0.025), 在未予胰島素治療GDM組與FPG、HbA1c、LDL-C、IL-1β呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.439(P=0.013)、0.452(P=0.021)、0.517(P=0.018)和0.602(P=0.009); Caspase-1在胰島素治療GDM組與FPG、HbA1c、LDL-C、IL-1β呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.578(P=0.021)、0.502(P=0.021)、0.491(P=0.017)和0.584(P=0.023), 見表3。

2.6 3組血清IL-1β、IL-18、TGF-β之間的Spearman相關(guān)性分析

IL-1β在GDM患者(未予胰島素治療GDM組、胰島素治療GDM組)與TGF-β呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.613(P=0.014)和0.729(P=0.009), 而三者之間在對照組無相關(guān)性,見表4。

表4 3組血清IL-1β、IL-18、TGF-β之間的相關(guān)性分析

3 討 論

正常孕婦由于體內(nèi)拮抗胰島素樣物質(zhì)增加,胰島素敏感性下降50%～60%, 同時胰島素代償性分泌增加以維持正常血糖。胰島素抵抗(IR)被認為參與GDM發(fā)生發(fā)展的病理生理過程[3-4]。IR是胰島素敏感性降低的一種病理生理狀態(tài),可由缺氧、糖脂代謝異常等通過炎癥反應介導而產(chǎn)生,炎癥因子很有可能是IR的“啟動子”[5-7]。

細胞焦亡是一種炎癥性程序性細胞死亡形式[8-9]。細胞焦亡的經(jīng)典途徑之一是通過NLRP3識別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式,激活由NLRP3、ASC和Caspase-1前體(pro-Caspase-1)組成的多蛋白復合體,即NLRP3炎性體,進而活化和產(chǎn)生Caspase-1; 活化的Caspase-1切割下游的Gasdermin D, 在細胞膜上形成孔洞,進而促進裂解性細胞死亡; 同時Caspase-1活化和釋放IL-1β、IL-18等炎癥因子,進一步誘發(fā)炎癥反應[9-10]。炎癥因子的表達增加促使抗炎因子TGF-β的過度表達。研究[11]指出, GDM患者胎盤組織中H2S合成酶缺乏,可能會過度激活NLRP3炎癥小體,促使炎癥反應引起細胞焦亡。

IL-1β作為趨化因子家族的一員,是重要的炎性細胞因子。一方面, GDM患者體內(nèi)高水平IL-1β可激活脂肪組織中的p38MAPK, 增強母體炎癥反應及IR; 另一方面,通過下調(diào)胰島素受體底物-1的表達,降低脂肪細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT-4D)及胰島素敏感基因PPARy的表達等途徑產(chǎn)生IR; 同時研究[12]發(fā)現(xiàn), GDM患者IL-1β rs16944 AA基因型與胰島素治療頻率及每日需求量的增加有關(guān)。通過小鼠試驗[13]發(fā)現(xiàn), IL-1β表達量在GDM小鼠子宮、胎盤組織及血液中均增加,而GDM小鼠應用抗IL-1β抗體后糖耐量得到改善,但胰島素分泌無顯著改變,表明抗IL-1β治療后有胰島素增敏作用。

IL-18作為一種促炎因子,被激活后可穿過細胞膜上的孔洞,促進炎癥因子的合成、聚集,引發(fā)炎癥反應[14]。本研究中, GDM患者血清IL-18水平升高,與武楠等[3]研究相符。FATIMA S S等[15]發(fā)現(xiàn), GDM患者IL-18水平升高與低度炎癥、IR有關(guān)。TARNOWSKI M等[16]研究發(fā)現(xiàn), IL-18 rs187238和rs1946518基因多態(tài)性可能影響孕婦GDM的發(fā)生風險。

TGF-β作為蛋白質(zhì)超家族的一員,可調(diào)節(jié)細胞生長和分化。活化的TGF-β可抑制β細胞增殖,加快β細胞凋亡,從而使得胰島素分泌減少。TGF-β通過促進纖溶酶原激活物抑制劑-1的表達誘導IR; 同時激活Smad3 信號通路,促進參與胰島素作用的相關(guān)基因和脂代謝基因的表達,進而導致IR[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn), TGF-β3 rs2284792的AA和AG基因型多態(tài)性可能與GDM患病風險增加相關(guān)。

本研究顯示, GDM患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達水平及其蛋白表達水平顯著性增加; 血清中IL-1β、IL-18、TGF-β水平顯著增加, ASC與IL-1β、IL-18呈正相關(guān), Caspase-1與IL-1β呈正相關(guān),且IL-1β與TGF-β呈正相關(guān),提示以NLRP3炎性小體為中心的細胞焦亡相關(guān)NLRP3-ASC-Caspase-1-IL-1β/IL-18-TGF-β信號通路可能在GDM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究[19]發(fā)現(xiàn),細胞焦亡促使胰腺β細胞數(shù)量減少和IR的發(fā)生。本研究認為,以NLRP3炎性小體為中心的細胞焦亡信號通路活化并產(chǎn)生下游炎性因子,進而介導IR,導致GDM的發(fā)生。研究[20]發(fā)現(xiàn), NLRP3炎性小體和細胞焦亡經(jīng)典途徑的激活可能促進脂肪或胎盤組織炎癥,參與GDM發(fā)生; OLMOS-ORTIZ A等[21]也認為,胎盤和脂肪組織中的炎癥反應是引起IR及進一步導致GDM發(fā)生的重要因素。韓寧等[22]研究發(fā)現(xiàn),細胞焦亡因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表達水平在GDM孕婦血清中顯著升高,這與本研究結(jié)果基本相符,同時研究指出由細胞焦亡誘發(fā)炎癥相關(guān)信號通路的激活,而產(chǎn)生的慢性炎癥狀態(tài)是導致IR的重要因素,且與孕婦不良妊娠結(jié)局風險的增加相關(guān)。

本研究顯示, GDM組患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達水平均顯著增加,且ASCmRNA與HbA1c、TG呈正相關(guān),Caspase-1mRNA與BMI、TC呈正相關(guān),提示在基因轉(zhuǎn)錄水平, GDM患者NLRP3炎性小體的表達顯著增加,糖脂代謝異常、高BMI可能對其起到促進作用。GDM組患者PBMCs中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達水平顯著增加,且ASC蛋白表達水平與FPG、HbA1c、TC呈正相關(guān), Caspase-1蛋白表達水平與FPG、HbA1c、LDL-C呈正相關(guān),提示在翻譯水平, GDM患者NLRP3炎性小體的表達顯著增加,高血糖、高血脂可能對其起到促進作用。溫金等[23]發(fā)現(xiàn),在GDM發(fā)病過程中,高糖可誘導細胞焦亡并釋放炎性介質(zhì),導致局部以及全身炎癥并引發(fā)IR, 與本研究結(jié)果相符。

綜上所述,激活NLRP3炎性小體表達的危險因素包括高血糖、高血脂及高BMI, 加強孕期對血糖、血脂、體質(zhì)量的控制,降低以NLRP3炎性小體為中心的細胞焦亡信號通路的激活,減輕不同炎癥因子之間互相交錯的炎癥反應,可能對GDM的防治、早期干預以及良好母嬰結(jié)局有重要意義。研究[24]發(fā)現(xiàn),過敏介質(zhì)阻釋劑——曲尼司特通過抑制NLRP3炎性小體的激活減輕炎癥反應,對GDM起到正向作用。進一步研究NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子的激活、調(diào)控機制,有望在細胞和分子水平進一步明確GDM的發(fā)病機制,為GDM的預防及診治提供潛在靶標和新突破點。