基于網絡藥理學及代謝組學的逍遙補腎方治療橋本甲狀腺炎的作用機制

劉婧，魏東升，安楊，孫欣，伊桐凝，張蘭

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院，沈陽 110847；2.沈陽市第二中醫醫院內分泌科，沈陽 110101；3.遼寧中醫藥大學附屬醫院內分泌科，沈陽 110032）

橋本甲狀腺炎 （Hashimoto thyroiditis，HT） 是一種臨床多發的自身免疫性甲狀腺疾病。研究［1］顯示，HT發病多與遺傳易感和環境因素聯合導致甲狀腺免疫耐受性破壞而攻擊自身有關。HT主要特征為甲狀腺過氧化物酶抗體 （thyroid peroxidase antibody，TPOAb） 和甲狀腺球蛋白抗體 （thyroglobulin antibody，TGAb） 陽性，臨床多表現為甲狀腺體積增加、淋巴細胞浸潤、甲狀腺組織破壞和瘢痕形成［2］。HT多從單純甲狀腺抗體升高逐漸發展為亞臨床甚至甲狀腺功能異常階段，最終出現甲狀腺功能減退，引發全身多系統低功能狀態，甚至可能發生癌變［3］。目前，西醫主要應用免疫調節劑、營養補充劑、調節甲狀腺激素藥物治療HT。近年來，研究［4］證明中醫藥對HT具有獨特而顯著的療效，不僅顯著降低HT患者的甲狀腺雙抗體滴度，同時還在調節T淋巴細胞水平、減少炎性細胞因子分泌等多方面發揮作用，具備不良反應小、復發少等優勢。

HT常與中醫學的“癭病”相關，其發病機制以肝郁氣滯、痰凝、血瘀或兼脾腎虧虛為主。逍遙補腎方是本研究基于臨床經驗結合古方逍遙散及腎氣丸加減化裁而成，是治療HT有效的復方中藥。方劑中柴胡、當歸、白芍分別從疏肝氣、養肝血、滋肝陰的角度助肝運行氣血；黨參、陳皮、白術、茯苓共同健脾，并分別從燥、化、利角度袪除痰濕水飲，助脾運化，生化氣血；熟地、山茱萸、山藥相配，固脫兼補腎、肝、脾之精；另佐桑葚、枸杞子滋陰養血、補肝腎益精，陰生則陽長；腎主司前后二陰，分別應用金櫻子和覆盆子固精縮尿，兼顧澀腸；炙甘草調和諸藥。方劑中15味中藥相互作用，共同發揮疏肝、健脾、補腎的效果，降低TPOAb和TGAb水平，明顯改善患者各種不適癥狀，有效控制HT的發展。因此，明確逍遙補腎方的潛在作用機制已成為目前研究的關鍵。

中藥由多成分構成，其作用機制復雜。網絡藥理學是一門前沿學科，主要應用各種組學和網絡分析技術構建和揭示藥物、成分、靶點和疾病的相互聯系，以闡釋藥物作用機制。代謝組學主要通過信息學結合高通量技術，明確各種條件下生物體內源性差異代謝物的情況。既往研究［5］發現，HT患者可能存在脂肪、多胺類、氨基酸等各種代謝紊亂。本研究基于網絡藥理學及代謝組學，系統分析逍遙補腎方的核心成分、靶點及差異代謝物，探討逍遙補腎方治療HT的可能作用機制，旨在為明確逍遙補腎方治療HT的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 逍遙補腎方中活性成分和靶點篩選：檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺數據庫 （traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP） （https：//tcmspw.com/tcmsp.php） 中3個藥物吸收、分布、代謝和排泄 （absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME）屬性，包括口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18，半衰期≥4 h，獲取逍遙補腎方 （15味中藥） 的主要活性化合物及相關作用靶點。將獲得的蛋白靶點在Uniprot蛋白數據庫 （https：//www.uniprot.org/） 統一規范；將獲得的DNA和RNA靶點在NCBI Gene數據庫 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/） 中標準化。

1.1.2 HT相關靶點篩選：以“Hashimoto Disease”為主題詞分別在GeneCards （https：//www.genecards.org/）、OMIM （https：//omim.org/）、DisGenet （https：//www.disgenet.org/）、TTD （http：//db.idrblab.net/ttd/）、pharmGKB （https：//www.pharmgkb.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/） 6個數據庫中檢索并篩選HT相關靶點，合并去重后利用Uniprot和NCBI Gene數據庫將靶點標準化。

1.1.3 逍遙補腎方-HT蛋白質-蛋白質相互作用 （protein-protein interaction，PPI） 網絡構建：應用Venny2.1.0軟件獲得逍遙補腎方與HT的交集靶點。STRING數據庫 （https：//cn.string-db.org/） 獲得交集靶點的分析結果輸入Cytoscape3.9.1軟件，建立交集靶點PPI網絡模型，選定“人類”物種，設置最小相互作用閾值>0.9。

1.1.4 核心成分及靶點篩選：應用Cytoscape3.9.1軟件內置“Network Analyzer”得到有效成分及靶點的網絡特征參數，包括連接度 （degree，D）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、緊密度中心性 （closeness centrality，CC），各特征參數取中位數，篩選出核心成分及靶點，構建“藥物-成分-交集靶點”網絡圖。

1.2 實驗驗證

1.2.1 材料及主要儀器：SPF級SD大鼠65只，雌性，（200±20） g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司［許可證號：SYXK （遼） 2020-0001］，于遼寧中醫藥大學動物實驗中心飼養。本研究獲得醫學倫理委員會批準 （21000042022049）。逍遙補腎方購自遼寧中醫藥大學附屬醫院，由柴胡6 g、當歸10 g、白芍15 g等藥物顆粒劑組成。質譜純級甲酸、乙腈、甲酸銨、超純水 （上海派森諾生物科技有限公司），Multiskan FC酶標儀 ［中國賽默飛世爾 （上海） 儀器有限公司］，Vanquish液相色譜儀、Q Exactive質譜儀 （美國Thermo公司）。

1.2.2 分組、造模及給藥：大鼠適應性喂養7 d后隨機分為對照組 （n= 10） 和造模組 （n= 55）。造模組按照高碘水喂養配合多次甲狀腺球蛋白注射誘導構建實驗性自身免疫性甲狀腺炎 （experimental autoimmune thyroiditis，EAT） 大鼠模型，以TPOAb、TGAb超過對照組2倍以上為造模成功［6］。將51只造模成功大鼠隨機分為模型組、硒酵母 （Se） 組、逍遙補腎 （XTK） 組，每組17只。Se組等效劑量為25.2 mg/ （kg·d），XTK組大鼠等效劑量為11.79 mg/ （kg·d），連續灌胃8周，對照組、模型組按照等體積的蒸餾水灌胃。

1.2.3 樣品的采集與處理：治療8周后大鼠禁食不禁水24 h，腹腔麻醉后腹主動脈釆血，分離血清，同時取結腸內新鮮糞便 （1～2枚），均-80 ℃凍存備用。大鼠糞便委托上海派森諾生物科技有限公司進行超高效液相色譜-串聯質譜法 （ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS） 代謝組學檢測，提取方法：精確稱量適量樣本于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇含2-氯-L-苯丙氨酸 （4 mg/L），渦旋振蕩30 s；應用組織研磨器（50 Hz） 研磨120 s；室溫超聲10 min；12 000 r/min 4℃離心10 min，上清液應用0.22 μm膜過濾后加入檢測瓶內，用于UPLC-MS/MS檢測，并從提取好的待測樣本中取部分混合成質量控制 （quality control，QC）樣本。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測核心靶點：ELISA檢測大鼠血清白蛋白 （albumin，ALB）、蛋白激酶B1 （protein kinase B1，AKT1） 和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 水平，檢測流程按試劑盒說明書進行。

1.2.5 ALB、AKT1和TNF-α水平的統計學分析：計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差（ANOVA） 分析，P< 0.05為差異有統計學意義。

1.3 代謝組學研究

1.3.1 色譜條件：Thermo Vanquish超高效液相系統（美國Thermo Fisher Scientific公司），使用ACQUITY UPLC?HSS T3 （2.1×150 mm，1.8 μm） 色譜柱 （美國Waters公司），0.25 mL/min 流速，40 ℃柱溫，進樣量 2 μL。正離子模式，流動相為 0.1%甲酸乙腈 （B2）與 0.1%甲酸水 （A2），梯度洗脫：0～1 min，2%B2；1～9 min，2%～50%B2；9～12 min，50%～98%B2；12～13.5 min，98%B2；13.5～14 min，98%～2%B2；14～20 min，2%B2。負離子模式，流動相為乙腈 （B3） 與5 mmol/L甲酸銨水 （A3），梯度洗脫：0～1 min，2%B3；1～9 min，2%～50%B3；9～12 min，50%～98%B3；12～13.5 min，98%B3；13.5～14 min，98%～2%B3；14～17 min，2%B3。

1.3.2 質譜條件：Thermo Q Exactive質譜檢測器 （美國Thermo Fisher Scientific公司），電噴霧離子源 （electrosprayionization，ESI），正負離子模式分別收集數據。正離子噴霧電壓：3.50 kV，負離子噴霧電壓：-2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度 325 ℃，分辨率70 000進行一級全掃描，一級離子掃描范圍100～1 000 m/z，并采用高能碰撞 （high energy collision dissociation，HCD） 進行二級裂解，碰撞能量為30 eV，二級分辨率為17 500，采集信號前10離子進行碎裂，同時采用動態排除刪除無必要的質譜/質譜（mass spectrometry/mass spectrometry，MS/MS） 信息。

1.3.3 代謝組學統計學分析：采用R軟件包XCMS處理峰的檢測、過濾及對齊。應用含有QC樣本的LOESS信號校正方法實現數據矯正，消除系統誤差。使用R軟件包Ropls對樣本數據進行主成分分析（principal components analysis，PCA） 及正交偏最小二乘判別分析 （orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。P< 0.05和變量權重值（variable importance for the projection，VIP） > 1為代謝物分子差異具有統計學意義。采用MetaboAnalyst軟件包對篩選差異代謝分子進行功能通路富集和拓撲學分析，并采用KEGG Mapper工具進行可視化分析。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

結果顯示，逍遙補腎方15味中藥經ADME篩選后共獲得236種主要活性成分，去重后共獲得201種活性成分及291個潛在標準化靶點。從GeneCards、OMIM、DisGenet、pharmGKB 4個數據庫獲得HT的相關靶點分別為3 365個、4 542個、335個、63個，TTD、DrugBank數據庫未獲得相關靶點；合并去重后共獲得6 316個HT靶點。將獲得的逍遙補腎方與HT相關靶點輸入Venny2.1.0獲得交集靶點246個。通過STRING對相互作用關系進行分析，得到交集靶點的相關數據，建立逍遙補腎方治療HT交集靶點的PPI網絡圖，見圖1。

圖1 逍遙補腎方治療HT的交集靶點PPI網絡圖Fig.1 PPI network diagram of intersecting targets of Xiaoyao tonifying kidney formula in the treatment of HT

應用NetworkAnalyzer插件計算相關參數，并經過中位數篩選獲得5個逍遙補腎方治療HT的核心靶點，包括ALB、AKT1、TNF、IL6、TP53 （表1）。構建“藥物-成分-交集靶點”網絡圖 （圖2），共獲得158個成分，245個靶點，420個節點，3 461條邊；篩選后獲得6個核心成分，分別為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、木犀草素。其中，槲皮素的D、BC、CC值最高，推測槲皮素為逍遙補腎方治療HT的核心成分，見表2。

表1 逍遙補腎方治療HT的前5位核心靶點網絡節點特征指數Tab.1 Top five network node characteristic indices of core targets of Xiaoyao tonifying kidney formula in treating HT

表2 逍遙補腎方治療HT的前6個核心成分網絡節點特征指數Tab.2 Top six network node characteristic indices of core components of Xiaoyao tonifying kidney formula in treating HT

圖2 藥物-成分-交集靶點網絡圖Fig.2 Network diagram of drug-component-intersection targets

2.2 各組大鼠血清ALB、AKT1和TNF-α水平比較

與對照組比較，模型組血清ALB、AKT1及TNF-α明顯升高 （P< 0.01）；與模型組相比，Se組及XTK組血清ALB、AKT1及TNF-α均顯著降低 （均P<0.01）；且XTK組比Se組降低更明顯 （P< 0.01），見圖3。

圖3 各組大鼠血清中ALB、AKT1和TNF-α水平比較 （±s，n = 10）Fig.3 Levels of ALB，AKT1，and TNF-α in the serum of rats in each group （±s，n = 10）

2.3 UPLC-MS/MS數據的多元統計分析

對各組大鼠糞便進行UPLC-MS/MS代謝組學分析，PCA得分表明正常組、模型組以及XTK組QC樣本聚集，說明重復性良好，結果可靠，并且各組間代謝物在一定程度上體現出了互相分離的趨勢，提示逍遙補腎方能夠調控EAT大鼠的代謝物，見圖4。OPLS-DA結果顯示正常組與模型組、模型組與XTK組彼此分離，各組組內樣本相互之間聚集程度明顯 （圖5A）；參數均滿足R2Y/Q2趨近于1，表明各組模型均無過度擬合，具有較好的解釋及預測能力 （圖5B）。

圖4 各組PCA得分情況Fig.4 PCA score charts in each group

圖5 OPLS-DA篩選差異代謝物Fig.5 OPLS-DA screening for differential metabolites

2.4 差異代謝物篩選及相關代謝通路富集

從樣本一級物質列表中尋找差異代謝物，按log2FC>0或<0，P< 0.05和VIP> 1篩選出模型組與正常組、XTK組與正常組、XTK組與模型組的差異代謝物 （表3）。篩選出3組的5個共同差異性代謝物，分別為 （4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z） -二十二碳六烯酸乙酯、（S） - （+） -檸蘋酸、2-酮-6-乙酰氨基己酸鹽、煙酰胺、黃氧酸。與對照組比較，模型組2-酮-6-乙酰氨基己酸鹽水平顯著降低 （P< 0.05），而其他4個差異代謝物的水平明顯升高 （均P< 0.05）。與模型組比較，XTK組 （S） - （+） -檸蘋酸水平明顯下降 （P<0.01），而其他共同差異代謝物的水平顯著上升 （均P< 0.05），見表4。

表3 差異代謝物篩選結果Tab.3 Screening results of differential metabolites

表4 各組共同差異代謝物水平比較Tab.4 Comparison of the levels of common differential metabolites in each group

差異代謝物通路富集分析結果顯示，篩選得到主要的20條代謝通路，包括苯丙氨酸代謝、味覺傳導、花生四烯酸代謝、卵巢類固醇生成、酪氨酸代謝等，見圖6。KEGG富集分析結果顯示逍遙補腎方可能通過上調苯丙氨酸、乙酸苯酯、2-羥基苯基丙酸酯、3-羥基苯乙酸酯，下調D-苯丙氨酸、苯乙胺、水楊酸鹽參與苯丙氨酸代謝 （圖7）。

圖6 差異代謝物通路富集分析Fig.6 Enrichment analysis of differential metabolite pathways

圖7 KEGG富集通路Fig.7 KEGG enrichment pathway

3 討論

本研究采用網絡藥理學及動物實驗對逍遙補腎方治療HT的核心靶點進行預測及驗證。結果顯示，逍遙補腎方可能通過降低ALB、AKT1及TNF-α的表達，改善HT的病情。ALB作為最豐富的甲狀腺素結合蛋白，它能夠聯合甲狀腺結合球蛋白、轉甲狀腺素蛋白運輸甲狀腺激素［7］。AKT1作為一種細胞存活途徑的中樞傳感器，臨床研究［8］證實，HT患者甲狀腺組織內AKT1水平較正常人顯著升高，在細胞存活、凋亡及炎癥反應的平衡之間發揮重要的作用。研究［9］顯示，降低TNF-α可以抑制HT過度的免疫應答，從而改善HT的炎癥損傷。本研究結果顯示，逍遙補腎方含有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等多種作用于HT的有效成分，其中，槲皮素可以抑制甲狀腺細胞生長，下調鈉/碘轉運基因水平［10］。同時，槲皮素可下調促甲狀腺激素受體、甲狀腺過氧化物酶和甲狀腺球蛋白基因，明顯抑制放射性碘攝取［11］。山奈酚作為天然的免疫抑制劑，可以在體外有效地抑制T淋巴細胞的活化和增殖，從而減少自身免疫性疾病的發生［12］。β-谷甾醇是一種植物甾醇，具有調節免疫、抑制癌癥等作用，研究［13］表明少量β-谷甾醇就可以提高體外T、NK細胞的增殖活性。

本研究結果顯示，逍遙補腎方治療HT能夠使差異代謝物 （S） - （+） -檸蘋酸和2-酮-6-乙酰氨基己酸鹽水平降低，同時 （4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z） -二十二碳六烯酸乙酯、煙酰胺和黃氧酸的水平明顯升高（均P< 0.05）。（S） - （+） -檸蘋酸主要參與C5-支鏈二元酸代謝等多種代謝通路。2-酮-6-乙酰氨基己酸鹽是賴氨酸降解的中間體，主要參與真核生物的轉錄激活。目前，對于 （S） - （+） -檸蘋酸和2-酮-6-乙酰氨基己酸鹽調節HT的研究鮮有報道，這兩種差異代謝物可能成為未來逍遙補腎方治療HT的研究重點。二十二碳六烯酸乙酯是脂質代謝產物中的脂肪酰類的一種，具有維護生物膜結構、抗自由基、廣泛減弱促炎性細胞因子的抗炎作用［14］。煙酰胺又稱為維生素B3，參與半胱氨酸和蛋氨酸等多種代謝途徑，可以抑制微生物生長，提高細胞內NAD+的水平，抑制PARP等關鍵酶的活性，從而發揮調節細胞免疫反應，增強DNA修復能力等多種作用［15］。黃氧酸主要參與類胡蘿卜素生物合成，足夠量的類胡蘿卜素可以降低多種疾病的患病風險，具有強抗氧化、抗炎、抗腫瘤等特性［16］；并且黃酮類化合物 （槲皮素與木犀草素） 與類胡蘿卜素 （番茄紅素、葉黃素） 能夠協同預防氧化應激［17］，與本研究結果一致。本研究結果顯示，XTK組 （4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z） -二十二碳六烯酸乙酯、煙酰胺和黃氧酸含量顯著上升，可能是機體在逍遙補腎方的作用下啟動了自身調節機制，減輕HT造成的炎癥損傷，對抗氧化應激并補充自身營養，從而促進HT恢復。

代謝通路富集分析結果顯示，逍遙補腎方治療HT與苯丙氨酸代謝、味覺傳導、花生四烯酸代謝、卵巢類固醇生成、酪氨酸代謝等通路關系密切。苯丙氨酸作為酪氨酸的來源之一，能夠影響酪氨酸對甲狀腺激素的合成［18］。甲狀腺作為新陳代謝的主要調節器，患有HT等甲狀腺疾病時可能會導致味覺異常［19］。花生四烯酸是人類不可缺少的一種多不飽和脂肪酸，經酶催化后會生成多種不同生物活性的類花生四烯酸，從而在炎癥、細胞凋亡、氧化應激、免疫力維護中起到調節作用［20］。有研究［21］表明，HT與卵巢貯備功能減退密切相關，甲狀腺功能紊亂對雌性動物生殖激素有一定影響，甲狀腺素作用于卵巢顆粒細胞后，可以干擾類固醇激素的合成［22］。有研究［23］顯示，酪氨酸作為甲狀腺激素的合成原料之一，對甲狀腺腫大的影響約占15%，高酪氨酸水平可以減輕甲狀腺腫大。可見，逍遙補腎方主要通過調節甲狀腺激素和卵巢類固醇合成、多種不飽和脂肪酸的生成等代謝途徑改善HT。

綜上所述，逍遙補腎方可以從多靶點、多成分、多代謝物、多通路對HT產生調節作用。本研究通過網絡藥理學結合代謝組學技術，對逍遙補腎方治療HT的核心靶點、成分、差異代謝物、代謝通路進行了分析，探討了逍遙補腎方治療HT的潛在作用分子及代謝機制，為逍遙補腎方臨床治療HT提供了新的理論依據。今后將對生物作用、核心通路等進行進一步的體外、體內實驗驗證，以明確逍遙補腎方調節HT的具體作用機制。