NLRP3、PD-L1、FoxP3和HPV在宮頸病變免疫微環境調節中的表達特征

王丹 任偉 岑鳳

【摘要】? 目的? ? 探討NLRP3、PD-L1、FoxP3和HPV在宮頸病變免疫微環境調節中的表達特征。方法? ? 選取2019年11月—2021年10月德安縣中醫院145例患者作為研究對象，分為宮頸癌組76例，CIN（宮頸上皮內瘤變）組39例，子宮肌瘤手術后證實無宮頸病變組30例，分別取3組患者的宮頸癌組織、CIN組織、子宮肌瘤組織進行免疫組織化學檢測。結果? ? NLRP3表達于細胞質中，其表達水平隨宮頸病變程度的加重而降低；PD-L1為棕黃色顆粒，表達于宮頸癌細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞；FoxP3為黑色顆粒，位于細胞核，表達于宮頸癌間質中腫瘤浸潤淋巴細胞，宮頸癌細胞無表達；NLRP3、PD-L1FoxP3、HPV在宮頸癌組織中表達與子宮肌瘤組、CIN組有顯著差異（P<0.05）。結論? ? NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV在宮頸病變免疫微環境調節中隨病變加重出現高表達，對癌癥發生、發展有一定作用，可將其作為治療靶點。

【關鍵詞】? 宮頸病變；免疫微環境調節；NLRP3；PD-L1；FoxP3；HPV

Expression characteristics of NLRP3，PD-L1，Foxp3 and HPV in immune microenvironment regulation of cervical lesions

Wang Dan，Ren Wei，Cen Feng.The Traditional Chinese Medicine Hospital of Dean County，Dean，Jiangxi? 330400

【Abstract】? Objective? ? To investigate the expression characteristics of NLRP3，PD-L1，Foxp3 and HPV in the immune microenvironment regulation of cervical lesions.Methods? ? 145 patients in our hospital from November 2019 to October 2021 were selected as the research objects. They were divided into 76 cases of cervical cancer group， 39 cases of CIN （cervical intraepithelial neoplasia） group and 30 cases of no cervical lesions confirmed after hysteromyoma surgery. The cervical cancer tissues， CIN tissues and hysteromyoma tissues of the three groups were detected by immunohistochemistry.Results? ? NLRP3 was expressed in the cytoplasm， and its expression level decreased with the aggravation of cervical lesions； PD-L1 is a brownish yellow granule， which is expressed in cervical cancer cells and tumor infiltrating lymphocytes； Foxp3 is a black granule， located in the nucleus and expressed in tumor infiltrating lymphocytes in the stroma of cervical cancer， but not in cervical cancer cells； The expressions of NLRP3， pd-l1foxp3 and HPV in cervical cancer were significantly different from those in hysteromyoma group and CIN group （P<0.05）.Conclusion? ? NLRP3， PD-L1， Foxp3 and HPV are highly expressed in the regulation of immune microenvironment of cervical lesions with the aggravation of lesions， which plays a certain role in the occurrence and development of cancer and can be used as therapeutic targets.

【Key Words】? Cervical lesions；Immune microenvironment；NLRP3；PD-L1；FoxP3；HPV

中圖分類號：R711.74? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）14-0020-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.14.007

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤疾病，且隨著生活水平的提高，其發病越來越年輕化，嚴重影響患者身心健康及生活質量[1]。人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染是導致宮頸癌發生、發展的重要因素，其感染多發生在性生活活躍女性，<50歲女性中多有HPV感染史，大多2年內會清除，少部分持續感染，侵犯于未分化宮頸角質形成細胞及分化出逃避免疫應答清除分子[2]。臨床上對HPV感染無特效藥，多是針對宮頸疾病病變進行治療。有相關研究指出，宮頸腫瘤的發生、病變及轉移與宮頸內的腫瘤細胞微環境因素關系密切[3]。所以，開展對HPV感染的宮頸病變免疫逃逸因子研究，以及早發現宮頸病變，對阻斷宮頸癌的發生、發展意義重大。本文通過免疫組織化學檢測NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV在宮頸病變免疫微環境調節中的表達特征，旨在分析其與宮頸病變的關系，報道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 選取德安縣中醫院2019年11月—2021年10月婦科收治的145例患者為研究對象，其中宮頸癌76例，CIN 39例，子宮肌瘤手術后證實無宮頸病變30例，本研究項目已經該院醫學倫理委員會批準。納入標準：經初診及手術治療、宮頸活檢病理診斷確診；無化療史；臨床資料完整；均自愿參加此次研究。排除標準：伴有心肝腎嚴重疾病者；急性炎癥者；自身免疫系統疾病及造血系統疾病者；伴有動脈粥樣硬化及其他腫瘤者；精神障礙者。宮頸癌組：年齡31～62歲，平均年齡（47.2±4.8）歲；根據國際婦產科聯盟（FIGO）分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期21例，Ⅲ期21例，Ⅳ期15例；組織分化程度：低分化26例，中分化31例，高分化19例。CIN組：年齡30～62歲，平均年齡（48.5±4.2）歲；CIN分級：Ⅰ級9例，Ⅱ級15例，Ⅲ15級。子宮肌瘤組：年齡31～63歲，平均年齡（47.8±4.7）歲。3組一般資料無明顯差異（P>0.05）。

1.2? ? 方法? ? 取3組患者的組織進行免疫組織化學檢測，包括NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV。進行連續切片，厚度為5 μm，脫蠟處理，經微波抗原，進行SP免疫組織化學，操作方法按照試劑的相關說明書進行?？贵w于4 ℃冰箱孵育過夜，標記二抗工作液室溫孵育30 min，經DAB顯色，蘇木精復染3～5 min，梯度酒精脫水，熒光倒置顯微鏡下觀察染色結果。染色均設置陽性陰性對照，將已證實的陽性切片作為陽性參照，以PBS代替一抗為陰性對照。

1.3? ? 觀察指標? ? 對細胞膜上、細胞質內陽性染色細胞的個數進行陽性判讀，檢測NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV的表達情況。擇取切片細胞數量最多的5個高倍視野，每視野取數細胞100個，由2名經驗豐富讀片醫師進行觀察，綜合分析染色強度及陽性細胞占比。染色強度標準：沒有著色0分，淡黃/淡黑1分，棕黃/棕黑2分，棕褐色/黑色3分；陽性細胞占比標準：0%～24%計0分，25%～49%計1分，50%及以上計2分。陽性判定：染色強度評分×陽性細胞占比評分，0～1分為陰性，陽性為2～6分。

1.4? ? 統計學方法? ? 采用SPSS 24.0統計學軟件處理數據，計量資料以x±s表示，行t檢驗，計數資料以百分比表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? ? 結果

NLRP3表達于細胞質中，其表達水平隨宮頸病變程度的加重而降低；PD-L1為棕黃色顆粒，表達于宮頸癌細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞；FoxP3為黑色顆粒，位于細胞核，表達于宮頸癌間質中腫瘤浸潤淋巴細胞，宮頸癌細胞無表達；NLRP3、PD-L1FoxP3、HPV在宮頸癌組織中表達與子宮肌瘤組、CIN組有顯著差異（P<0.05），見表1。

3? ? 討論

宮頸病變是高發女性疾病，其早期臨床表現不明顯，易被忽視，進展到一定程度后形成癌癥，嚴重影響女性身心健康及生命安全。所以，對宮頸病變的檢查防治非常重要。臨床相關研究顯示，生殖道HPV感染非常普遍，感染率達30%～40%；也有研究顯示，宮頸癌患者中約有90%的感染HPV，HPV感染是宮頸癌發生的啟動因子，臨床普遍認為HPV持續感染和宮頸局部免疫微環境改變的疊加作用促進了宮頸癌的發生[4]。不同類型的HPV感染和宮頸癌病變及病情有較大的關系，有研究指出，高危HPV大多在2年內會被自然清除，少數會進展為宮頸癌，認為HPV持續感染引發宮頸癌與HPV抑制機體免疫應答有關[5]。當細胞因子、促炎因子、免疫細胞形成的腫瘤免疫微環境的免疫抑制作用高于免疫應答時，病毒就會無法清除，進而持續存在而誘發宮頸局部的免疫微環境出現失衡。所以，加強腫瘤微環境對話網絡中決定性環節的研究，能為免疫治療阻斷宮頸癌的發生發展提供有效依據。

HPV感染后出現的疾病轉歸和機體免疫功能有關，尤其是和宮頸局部微環境免疫功能密切相關。免疫抑制細胞構成免疫抑制微環境，經免疫耐受和免疫逃逸機制促進宮頸病變的發展。盡管在宮頸癌階段腫瘤細胞快速生長，但機體內部仍會產生抗腫瘤免疫反應，因腫瘤免疫抑制微環境控制無法發揮生物效用，所以免疫抑制微環境非常重要。宮頸微環境免疫監視功能及免疫逃逸對宮頸癌的發生、發展起著重要作用。免疫系統中，免疫監視是重要功能，能起到識別和抑制異常細胞的作用，宮頸微環境中的腫瘤抑制性免疫細胞因子能減弱機體免疫功能，降低清除受損DNA、異常細胞能力，使受損DNA持續復制、異常細胞增殖，引起癌癥發生及發展[6]。NLRP3是模式識別受體一員，對機體先天免疫應答有重要作用，能識別病原分子模式、危險分子模式，促進產生分泌炎性介質，參與炎癥反應應答，NLRP3還能調節caspase-1依賴的細胞凋亡，加重機體炎癥反應。有研究顯示，婦科疾病、宮內膜癌均與NLRP3均有密切關系[7]。程序性死亡配體-1（PD-L1）又稱為B7-H1，是PD-1受體中的一員，屬于細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4受體，是免疫反應中的協同分子，起到腫瘤微環境免疫耐受主導性作用；分為膜型和可溶型兩種，廣泛表達于免疫細胞核非造血細胞及浸潤淋巴細胞中，如活化T細胞、活化B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞及活化的髓系細胞（單核細胞、NK細胞）。有多個臨床研究顯示，PD-L1在肺癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌中均有組成性表達，是腫瘤組織表達預后不良的因素[8]。在肺癌、食管癌、卵巢癌中表達于腫瘤細胞細胞膜中，在宮頸癌中則表達于細胞胞漿中。吳雪燕等研究顯示，宮頸鱗狀細胞癌的組織中，PD-L1有升高現象[9]。提示PD-L1在惡性腫瘤中異常高表達，與腫瘤浸潤淋巴細胞的PD-1一起抑制周圍淋巴細胞的活性，使腫瘤細胞避開了免疫系統監視及攻擊。本文研究結果顯示，宮頸癌組的PD-L1表達均比子宮肌瘤組和CIN組更高（P<0.05），與吳雪燕研究結果一致。說明異常分化細胞中的PD-L1表達隨宮頸細胞的惡性轉化進程而增多，其可能參與宮頸細胞的惡性分化。表明異常分化細胞過表達和宮頸病變進程及腫瘤細胞分化的程度有一定關系，推測異常分化宮頸細胞過表達PD-L1會賦予細胞免疫抑制效應，使腫瘤免疫微環境出現免疫抑制強于免疫應答的狀態，進而促進宮頸病變進程。

Treg是調節機體免疫體系的細胞，于惡性腫瘤中高表達，對宮頸癌發生、發展作用較大。FoxP3叉頭翼狀螺旋轉錄因子是Treg的重要標志，參與Treg細胞的激活功能，是動態平衡調節免疫的因子，有一定的免疫抑制性，和其他細胞接觸分泌出抑制性細胞因子，進而抑制免疫細胞活化[10]。FoxP3主要表達于腫瘤浸潤淋巴細胞，整體蛋白構成為431個氨基酸，是CD4、CD25、Treg發生功能關鍵因子，是Treg可靠表面標志物，在腫瘤局部免疫微環境中有重要的作用。有多個臨床研究顯示，FoxP3在乳腺癌、肝癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌等中均在腫瘤細胞或Treg中表達，是腫瘤預后不良的重要因素。本文研究顯示，宮頸癌組的FoxP3表達陽性率均比子宮肌瘤組和CIN組高，CIN組的FoxP3陽性表達率高于子宮肌瘤組（P<0.05）。結果說明，宮頸癌組織中的FoxP3表達出升高趨勢。Treg抑制細胞活化，阻滯免疫系統的監視功能，使腫瘤抗原抗體無法發生免疫反應，創造腫瘤細胞免疫逃逸條件，加速腫瘤發展。FoxP3和PD-L1的異常分化細胞在宮頸免疫微環境中具有協同作用，提示存在FoxP3激活PD-L1信號通路，發揮免疫抑制的作用，可為宮頸病變的治療及宮頸癌的預防提供新思路。

綜述所述，NLRP3、PD-L1、FoxP3、HPV在宮頸病變免疫微環境調節中，隨病變加重出現高表達，對癌癥發生、發展有一定作用，可將其作為治療靶點。

參考文獻

[1]? ?BRAY FREDDIE，FERLAY JACQUES，SOERJOMATARAM ISABELLE，et al.Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin，2018，68：394-424.

[2]? ? 蘇雅婷，牛雯娟，段文杰，等.陰道微生物在宮頸癌中作用機制的研究進展[J].國際婦產科學雜志，2021，48（2）：126-130.

[3]? ? 舒俊俊，龔丹，楊云華.南昌地區女性陰道微生態環境及HPV陽性與宮頸病變的相關性研究[J].現代醫院，2019，19（8）：1188-1190.

[4]? ? 王婷婷，馮曉娜，李娜.育齡女性生殖道感染對宮頸癌及宮頸上皮內瘤變的影響[J].黑龍江醫藥科學，2017，40（6）：43-44.

[5] KATRIN CHRISTINE.Vaginal and Urine Self-sampling Compared to Cervical SamplingforHPV-testing with the Cobas 4800 HPV Test[J].Anticancer research，2017，37（8）：4183-4187.

[6]? ? 馬茜，趙敏伊，魏星，等.免疫調節細胞FoxP3+Treg及免疫蛋白PD-L1在宮頸病變微環境中的表達[J].中國醫學科學院學報，2017，39（1）：128-132.

[7]? ? 余楊，付艷麗，孫翔.不同宮頸病變高危型人乳頭狀瘤病毒載量對局部調節性T細胞表達的影響[J].實用醫學雜志，2018，34（4）：583-587.

[8]? ? 劉暢，李坤，舒麗莎，等.B7-H4和Foxp3+Treg在宮頸病變組織中的表達及臨床意義[J].重慶醫學，2019，48（17）：2960-2963.

[9]? ? 吳雪燕，周遵倫，張梅.陰道微環境與人乳頭瘤病毒感染及宮頸上皮內瘤變相關性的研究進展[J].貴州醫藥，2021，45（2）：191-193.

[10]? ? 徐曉琳，田春艷，耿云峰，等.核因子κB信號通路在宮頸癌、乳腺癌發生發展及治療中作用的機制研究進展[J].山東醫藥，2019，59（18）：99-103.

（收稿日期：2023-02-10）