抗癌活性鈦雙齒配合物的環糊精負載研究

任曉燕

(淮南聯合大學 制藥與材料學院，安徽 淮南 232038)

癌癥作為一種發病率和死亡率極高的重大疾病，已經嚴重威脅到了人類的身體健康及生命安全[1]。含有金屬的藥物在癌癥治療領域中起到了了舉足輕重的作用。具有代表性的鉑類抗癌藥物有順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等，但鉑類藥物具有較為嚴重的副作用及長期臨床使用產生了耐藥性，使其在臨床上的使用受到了一定的限制[2]。為解決鉑類抗癌藥物的不足，科研人員致力于開發其他非鉑類金屬抗癌藥物，多種金屬如釕(Ru)、鎵(Ga)、鍺(Ge)、鈀(Pd)、金(Au)及鈦(Ti)等配合物的抗癌活性得到了廣泛的研究，部分金屬配合物對一種或者多種癌癥的治療表現出了較好的效果[2]，研究發現它們不僅在癌癥治療領域表現優異，配合物自身的物理性質如水氧穩定性也有顯著提升且毒副作用進一步降低，具有成為新型抗癌藥物的潛質。然而金屬配合物也存在一定的限制因素，其中一個主要的方面是金屬配合物的水溶性難以提升。

鈦配合物是人們較早開始研究的金屬抗癌藥物，二氯二茂鈦和布度鈦為上世紀80年代進入臨床實驗的抗癌先導化合物，他們對多種順鉑耐藥的腫瘤細胞有優異的抑制活性作用。布度鈦與二氯二茂鈦在癌癥治療領域取得了重大的突破，但是水穩定性的不足導致它們在II期臨床試驗中失敗[3]。2007年，TSHUVA等[4]報道了雙酚二氨基型Salan鈦配合物對HT-29和OVCAR-1兩種腫瘤細胞的抑制活性，并證實了其細胞滲透的穿膜方式。Salan鈦配合物的抗癌譜系、“結構-活性-穩定性”、抗癌活性分子亦得到了陸續的報道[5]。取代空間結構靈活的烷氧基得到的剛性鈦配合物具有良好的抗癌活性及優異水氧穩定性[6]且對胃腸道的腫瘤細胞具有選擇性抑制作用，無骨髓抑制毒性且可與抗腫瘤藥物聯合用藥[7]，是極具有開發潛力的新型金屬抗癌藥物分子，但這類配合物的肝臟富集較為嚴重，其水溶性有待于進一步提升。

環糊精(CD)具有良好的非還原性、多孔性、熱穩定性、無吸濕性等，其物理化學性質極其穩定，不會輕易地在酸性環境中水解[8]。環糊精及其衍生物具有特殊的內親油、外親水的空腔結構，這種空腔結構可包裹藥物分子，從而成為提升藥物分子水溶性的高效載體[9]。環糊精及其衍生物作為藥物分子高級載體的相關研究已成為了近年來的研究熱點[10]。研究選擇了具有Salan鈦的2，6-吡啶二甲酸雙齒配合物，研究了環糊精對該配合物的包裹條件及純化手段，并通過核磁、高分辨質譜及高效液相色譜對包合物進行了鑒定并計算了包合率。

1 實驗設計

1.1 化學藥品和試劑

2，4-二甲基苯酚、N，N’-二甲基乙二胺、鈦酸異丙酯、2，6-吡啶二甲酸購自上海麥克林生化科技有限公司。甲醇及40%甲醛溶液購自天津市嘉宇精細化工有限公司。四氫呋喃(THF)購自天津市大茂化學試劑廠。環糊精購自阿拉丁試劑公司。二氯甲烷、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯等常用溶劑購自煙臺市雙雙化工有限公司。薄層層析硅膠GF254購自青島譜科分離材料有限公司。

1.2 實驗設備及儀器

ZF-1型三用紫外線分析儀購自上海金鵬分析儀器有限公司，CJJ78-1磁力加熱攪拌器購自金壇市大地自動化儀器廠，2XZ-2型旋片真空泵購自浙江黃巖天龍真空泵廠，循環水式多用真空泵購自鄭州長城科工貿有限公司，旋轉蒸發儀購自鄭州長城科工貿有限公司，GZX-9240 MBE數顯鼓風干燥箱購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠，HX501T電子天平購自慈溪市天冬衡器廠，XMTD數顯調節儀購自余姚市金電儀表有限公司，分析天平購自梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司，結晶皿、燒杯、錐形瓶、圓底燒瓶等玻璃器材購自四川蜀玻(集團)有限責任公司。LC5090高效液相色譜儀購自浙江福立分析儀器股份有限公司，布魯克 AVANCE NEO 核磁共振 (NMR)波譜儀購自布魯克(北京)科技有限公司。

1.3 配體的合成

將2，4-二甲基苯酚(1.2 mL，20 mmol)與N，N’-二甲基乙二胺(0.5 mL，10 mmol)加入到裝有5 mL甲醇和5 mL 40%甲醛溶液的圓底燒瓶中，該混合溶液在80 ℃條件下攪拌加熱回流24 h。反應停止后靜置使其冷卻至室溫后繼續冷卻至6 ℃，用砂芯漏斗抽濾析出白色晶體，用適量的冰甲醇洗滌濾餅，干燥，即得到2，4-二甲基Salan配體。如圖1所示。

圖1 2，4-二甲基Salan配體的合成

1.4 [(Salan)Ti(Dipic)]的合成

將2，4-二甲基Salan配體(500 mg，1.40 mmol)加入到20 mL THF中，在N2保護條件下加入鈦酸異丙酯Ti(OiPr)4(0.5 mL，1.68 mmol)，反應溶液變為黃色，室溫下攪拌半小時后加入2，6-吡啶二甲酸(257.21 mg，1.54 mmol)，反應液立即由黃色變為紅色，反應2 h后由柱層析進行分離(石油醚/乙酸乙酯=3/1，二氯甲烷/甲醇=3/1)得到紅色塊狀固體746.17 mg，產率94%。(圖2)

圖2 2，4-[(Salan)Ti(Dipic)]的合成

1.5 [(Salan)Ti(Dipic)]-CD的合成

由于鈦雙齒配合物[(Salan)Ti(Dipic)]不溶于水而環糊精具有較好的水溶性，我們設計了一條獨特的包合路線：將[(Salan)Ti(Dipic)](300 mg，0.52 mmol，1.0 equiv. )在超聲協助下分散于15 mL去離子水中，繼而加入590 mg的β-環糊精 (0.52 mmol，1.0 equiv.)，60oC條件下攪拌反應過夜。反應停止后過濾除去未反應的鈦配合物，將濾液在真空條件下除去得到包合產物，如圖3所示。

圖3 環糊精對[(Salan)Ti(Dipic)]的包裹

2 結果與討論

2.1 [(Salan)Ti(Dipic)]及環糊精包合物的高分辨質譜

[(Salan)Ti(Dipic)]和[(Salan)Ti(Dipic)]-CD分別用高分辨率質譜進行了表征，[(Salan)Ti(Dipic)][M+H]+HRMS (ESI-TOF)m/z計算值：567.184 9。實驗值：567.185 6。 [(Salan)Ti(Dipic)]-CD[M+H]+HRMS (ESI-TOF)m/z計算值：1 701.554 6。實驗值：1 701.553 8。

2.2 CD和[(Salan)Ti(Dipic)]-CD的1H-NMR

以D2O為氘代試劑，對CD和[(Salan)Ti(Dipic)]-CD分別進行了1H-NMR測試。經由測試結果顯示，未顯現出藥物分子的特征峰，兩者的1H-NMR幾乎完全一致，推測可能由于環糊精對鈦配合物進行完全包裹，使得鈦配合物的核磁信號被完全遮蔽，如圖4所示。

圖4 CD的1H-NMR(左)和[(Salan)Ti(Dipic)]-CD的1H-NMR(右)

2.3 CD、[(Salan)Ti(Dipic)]及[(Salan)Ti(Dipic)]-CD高效液相色譜分析

經過篩選，最終確定使用依利特SinoPak C18色譜柱十八烷基鍵合硅膠反向固定柱為固定相，流動相使用90%的乙腈對鈦配合物，環糊精和包合物開展了高效液相色譜分析，環糊精的極性最大，保留時間時間最短，為3.7 min；包合物的極性較環糊精略小而保留時間較長，為4.4 min；鈦配合物的極性最小而保留時間最長，為12.2 min。(圖5)

圖5 β-CD(上)、[(Salan)Ti(Dipic)]-CD(中)及[(Salan)Ti(Dipic)](下)的高效液相色譜圖

2.4 β-環糊精包合率的測試

使用不同當量比的鈦配合物和環糊精，利用上述包合物合成的方法進行包裹實驗，并由高效液相色譜法對包裹率進行了測定和計算。研究結果表明，提高鈦配合物的當量反而會導致包合率下降，選擇低當量比有利于更好的對配合物進行包裹。

通過利用高相液相色譜圖的峰面積對包合率進行了計算，首先稱取113.4 mg β-CD (0.1 mmol)，用5 mL 去離子水溶解，利用高相液相色譜進行分析并計算出標準樣品中β-CD的峰面積，然后分別取56.7 mg / 85.05 mg / 113.4 mg[(Salan)Ti(Dipic)](0.1 / 0.15 / 0.2 mmol)與113.4 mg CD(0.1 mmol)按上述[(Salan)Ti(Dipic)]-CD的合成方法制成包合物，過濾除去多余的[(Salan)Ti(Dipic)]，并對其水相進行高相液相色譜分析，計算出樣品中未包合的CD的峰面積，然后利用下式計算出包合率。

表1 環糊精包合率(當量比為兩種物質的摩爾比)

3 結語

通過針對具有抗癌活性的[(Salan)Ti(Dipic)]配合物，利用超聲及溶解度差異設計并開展了環糊精包裹的研究，并通過核磁共振氫譜、高效液相等分析手段對包合物的結構進行了鑒定。并證實最佳包封率為1∶1當量，增大鈦配合物的當量導致包合率減小。通過對環糊精對鈦配合物的包裹載體的研究，鈦配合物的環糊精載藥體系不僅具備提升的水溶性，從而有望提升藥物的生物利用度，為發展抗癌活性鈦配合物以及金屬配合物的新型藥物載體提供研究基礎，為開發其靶向給藥體系提供了思路和方法。