紅景天對急性髓系白血病潛在治療作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

紀(jì)穎慧，丁傳華，唐琳琳，劉文山

（濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261031）

急性髓系白血病（AML）為造血系統(tǒng)惡性腫瘤，當(dāng)病情發(fā)展時，異常原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞會大量增殖并干擾正常的造血過程，同時還會侵襲和浸潤肝、脾、淋巴結(jié)等多個器官。中醫(yī)古籍中無AML 病名的記載，根據(jù)該病的發(fā)病特點和臨床表現(xiàn)，現(xiàn)多將其歸為“溫病”“虛勞”“血證”“痰核”等范疇，總病機(jī)為正虛邪實、虛實夾雜［1］。現(xiàn)階段，化學(xué)藥物治療仍是AML 治療的主要方法。紅景天有益氣活血、通脈平喘功效，主治氣虛血瘀，胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘［2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，紅景天具有抗癌、保護(hù)心腦血管、抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗疲勞和抗抑郁等諸多功效［3］，臨床廣泛用于抗腫瘤、防治缺血性腦卒中和多種心肝肺等臟器疾病。但目前紅景天用于防治AML 的相關(guān)報道較少，且其作用機(jī)制尚未明晰。本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討紅景天治療AML 的潛在藥理學(xué)作用機(jī)制，以期為臨床治療AML 提供新的用藥思路，并為后續(xù)的新藥研發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 紅景天有效成分及作用靶點篩選

通過檢索中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP）、本草組鑒平臺（HERB，http：//drug.ac.cn/）及相關(guān)文獻(xiàn)，收集紅景天的有效成分，并導(dǎo)入PubChem 數(shù)據(jù)庫，（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索化合物結(jié)構(gòu)。利用SwissADME數(shù)據(jù)庫（http：//www.swissadme.ch/）對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與篩選，設(shè)置篩選條件為：藥物代謝動力學(xué)（簡稱藥動學(xué)）模塊中胃腸吸收為高，類藥性（DL）模塊中5 個過濾條件（Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge）中≥2 個條件結(jié)果為“Yes”。利用Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：// www.swisstargetprediction.ch/）對篩選得到的成分進(jìn)行靶點預(yù)測，選擇Probability ≥0.1 的靶點。剔除重復(fù)和無化學(xué)結(jié)構(gòu)或無作用靶點的藥物成分，最終建立紅景天的有效成分與作用靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 中藥與疾病共有靶點篩選

利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：// www.genecards.org/）檢索得到AML 疾病相關(guān)靶點，選取其中Relevance score>4次中位數(shù)評分的靶點，利用Venny 2.1在線平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制中藥與疾病靶點的維恩圖，并獲取兩者的共有靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

將共有靶點導(dǎo)入String 網(wǎng)站（https：// cn.string -db.org/ ），設(shè)置minimum required interaction score =0.400，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并以tsv格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件進(jìn)行可視化處理。利用CytoNCA 插件分析PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選節(jié)點度值（degree）≥55的靶點為核心靶點。

1.4 富集分析

將共有靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，獲取共有靶點的生物學(xué)信息。兩者均選取P<0.01的結(jié)果進(jìn)行分析。通過微生信在線平臺（http：// www.bioinformatics.com.cn）對其結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.5 中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

選擇KEGG 分析結(jié)果中富集基因數(shù)量排名前10 的信號通路，與紅景天的有效成分、共有靶點相結(jié)合，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件，構(gòu)建中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)。分析紅景天作用于AML 的有效成分及通路。

1.6 分子對接驗證

將核心靶點與其對應(yīng)的紅景天有效成分進(jìn)行分子對接。結(jié)合能越低，則配體與受體結(jié)合的穩(wěn)定性越高［4］。將有效成分化合物結(jié)構(gòu)輸入Chem3D軟件進(jìn)行自由能最小化處理。利用PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點的蛋白結(jié)構(gòu)。將靶點蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMOL軟件去除水分子和小分子配體，利用AutoDock Tools 軟件為靶點蛋白加氫并建立活性口袋。將處理后的化合物分子與靶點蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接，評價兩者的結(jié)合活性，選取各靶點對接全部結(jié)果中結(jié)合能絕對值最高的一組（若多組并列最高，則隨機(jī)選取其中一組），并用PyMOL軟件對其可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 紅景天的有效成分及作用靶點

初步得到紅景天有效成分160個，其中TCMIP平臺7 個、HERB 平臺26 個、文獻(xiàn)［5-6］127 個。最終獲得紅景天有效成分34個，作用靶點336個。

2.2 中藥-疾病共有靶點

初步得到AML 疾病相關(guān)靶點13 993 個，最終獲得AML疾病相關(guān)靶點874個，并得到中藥-疾病共有靶點81個（見圖1）。

圖1 紅景天與急性髓系白血病靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of Rhodiolae Crenulatae Radix et Rhizoma and AML - related targets

通過共有靶點，得到與AML靶點相關(guān)中藥有效成分22個，主要包括kaempferol（山柰酚）、quercetin（槲皮素）、borneol（冰片）、tricin（麥黃酮）、velutin（氈毛美洲茶素）、tamarixetin（檉柳素）、herbacetin（草質(zhì)素）、7-hydroxycoumarin（7-羥基香豆素）、gallic acid（沒食子酸）等。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點

中藥-疾病共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析圖見圖3，degree 排名前5 的核心靶點分別為GAPDH（degree = 67）、TP53（degree = 66）、AKT1（degree=64）、VEGFA（degree=58）、EGFR（degree=55）。

圖2 中藥-疾病共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of common targets of traditional Chinese medicine-disease

圖3 中藥-疾病共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析圖譜Fig.3 Visual analysis of common target PPI of traditional Chinese medicine-disease

2.4 富集分析

GO分析：共獲得209項生物學(xué)過程（BP），主要包括凋亡過程負(fù)向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖正向調(diào)控、蛋白磷酸化等；56 項分子功能（MF），主要包括蛋白結(jié)合、三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合、蛋白同型二聚化活性、蛋白激酶活性等；36項細(xì)胞組分（CC），主要包括細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)液、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、胞外區(qū)等。分別選取靶點蛋白富集數(shù)量排名前10的富集結(jié)果繪制柱狀圖（見圖4 A）。

圖4 富集分析結(jié)果Fig.4 Results of enrichment analysis

KEGG 分析：共得到信號通路101 條。以靶點蛋白富集數(shù)量排名前30的富集結(jié)果繪制氣泡圖（見圖4 B）。其中靶蛋白富集數(shù)量排名前10 的信號通路為癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、癌癥中的微小RNA（miRNA）、癌癥中的蛋白聚糖、Rap1 信號通路、細(xì)胞衰老、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、Ras信號通路等。

2.5 中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)見圖5。

圖5 中藥-成分-共有靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Network of traditional Chinese medicines-ingredients-common targets-pathways-disease

2.6 分子對接驗證

將核心靶點GAPDH，TP53，AKT1，VEGFA，EGFR與其對應(yīng)中藥有效成分進(jìn)行分子對接。結(jié)合能均不超過-4.80 kcal/mol（見表1），提示藥物成分與靶點之間具有良好的親和力（結(jié)合能<0 kcal/mol提示具有親和力）。分子對接可視化分析結(jié)果見圖6。

表1 分子對接結(jié)果Tab.1 Results of molecular docking

圖6 分子對接展示圖Fig.6 Display of molecular docking

3 討論

本研究結(jié)果顯示，紅景天核心有效成分主要包括山柰酚、槲皮素、草質(zhì)素、檉柳素、氈毛美洲茶素、麥黃酮等，其在紅景天對AML 的藥理機(jī)制中有重要作用，這與既往研究結(jié)果基本一致［6］。槲皮素為黃酮類化合物，可通過降低體內(nèi)炎性因子的表達(dá)抑制炎性反應(yīng)，且具有抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用［7］。有研究表明，槲皮素能抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)鐵死亡，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。山柰酚為有抗腫瘤作用的類黃酮，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和自噬等作用來抑制腫瘤組織生長［9］。張琴［10］通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，山柰酚能顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，且抑制效果隨藥物濃度增大而增強(qiáng)。草質(zhì)素為黃酮類化合物，主要存在于紅景天、棉花等植物中，在清除自由基及防止蛋白氧化方面具有顯著作用［11］。紅景天有效成分具有抗腫瘤、抑制細(xì)胞增殖、抑制炎性反應(yīng)等作用，這為其防治AML提供了可能的理論基礎(chǔ)。值得注意的是，紅景天苷也是紅景天的主要活性成分之一，其藥理作用也是近年來的研究熱點［12］。但本研究中的潛在有效成分中無紅景天苷，不排除與部分?jǐn)?shù)據(jù)庫的更新滯后或紅景天苷的首過效應(yīng)有關(guān)。

在中藥-疾病共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)中，degree排名前5的核心靶點在紅景天防治AML 的潛在作用機(jī)制中均有重要作用。其中，GAPDH 為糖酵解酶，在人體糖代謝過程中起關(guān)鍵作用，幾乎在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，且參與非糖酵解過程，如細(xì)胞凋亡、腫瘤形成、DNA 修復(fù)、細(xì)胞膜融合等［13］。VEGFA 是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的家族成員之一，與血管生成關(guān)系密切，在AML 的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［14］。TP53 是人類癌癥中最常見的突變基因，在癌癥發(fā)生、細(xì)胞衰老、DNA 修復(fù)等基本生物學(xué)過程中具有核心作用，被認(rèn)為與AML 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［15］。此外，本研究中核心靶點與相應(yīng)的紅景天有效成分的分子對接結(jié)合能結(jié)果提示，靶點蛋白與藥物有效成分之間親和力較好，結(jié)合較穩(wěn)定。

本研究結(jié)果顯示，中藥- 疾病共有靶點所作用的CC更多地集中于細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)液、細(xì)胞核、細(xì)胞膜、胞外區(qū)等，通過蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、蛋白同型二聚化活性、蛋白激酶活性等MF，實現(xiàn)對細(xì)胞凋亡過程負(fù)向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖正向調(diào)控、蛋白磷酸化等BP發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，此過程可能是紅景天對AML潛在療效的生物學(xué)機(jī)制。與中藥- 疾病共有靶點相關(guān)的信號通路主要包括PI3K - Akt 信號通路、癌癥中的miRNA 等。PI3K-Akt通路與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、代謝和運動等過程有關(guān)，研究表明，該通路在人類癌癥發(fā)生發(fā)展中普遍被激活，該通路的抑制可促進(jìn)人體腫瘤消退［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，通過影響miRNA 的表達(dá)量可靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡信號通路，這可能為腫瘤治療提供了新思路［17］。

綜上所述，本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)初步預(yù)測了紅景天治療AML 的潛在藥理學(xué)作用機(jī)制。紅景天的主要有效成分包括山柰酚、槲皮素、草質(zhì)素、檉柳素、氈毛美洲茶素、麥黃酮等，通過與核心靶點GAPDH、TP53、AKT1、VEGFA、EGFR 等的良好結(jié)合，作用于PI3K-Akt、癌癥中的微小RNA 等信號通路，從而發(fā)揮對AML 的潛在療效。這提示紅景天治療AML 可能是一個“多成分、多靶點、多通路”的過程，也為今后臨床靈活運用紅景天治療AML提供理論依據(jù)。