螞蟥藥材炮制前后質(zhì)量研究*

邱韻靜，胡綺萍，童培珍，楊 麗，鄧立萍，李國(guó)衛(wèi)，孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司·廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman 或柳葉螞蟥Whitmania acranulataWhitman 的干燥全體［1］，味咸、苦，性平，有小毒，歸肝經(jīng)，有破血通經(jīng)、逐瘀消瘕功效，常用于治療血瘀經(jīng)閉、癥瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌撲損傷等癥。水蛭主要有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗炎等藥理作用［2］，臨床廣泛用于治療血栓、高脂血癥、高血壓、糖尿病、前列腺炎、癌癥、靜脈曲張、不孕、肝硬化等病癥［3］。主要成分為大分子類（蛋白質(zhì)）化合物，并含17種氨基酸（其中8種為人體必需氨基酸），水解氨基酸含量高達(dá)49.4%；還含水蛭素、肝素、組織胺、吻蛭素、糖脂類、蝶啶類、甾體類、羧酸酯類等物質(zhì)［4］。目前，對(duì)水蛭的研究集中于抗凝血機(jī)理［5-7］及氨基酸測(cè)定［8-9］方面，為此，本研究中建立了動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman 及其炮制品燙螞蟥的特征圖譜，并測(cè)定其成分尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、水蛭胺C羧基衍生物、水蛭胺B的含量，以為區(qū)分兩者及行整體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo UltiMate 3000 型高效液相色譜儀，Thermo Fisher QE 型高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技有限公司）；KQ - 500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 型電子分析天平、XP26 型電子分析天平、FE28型pH 計(jì)（瑞士Mettler Toledo 公司，前兩者精度分別為0.1 mg，0.001 mg）；CHA - SA 型氣浴恒溫振蕩器（常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠）；HH-M8型雙列八孔水浴鍋（江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司）。

1.2 試藥

尿嘧啶對(duì)照品（批號(hào)為100469 - 201302，含量99.6%），次黃嘌呤對(duì)照品（批號(hào)為140661-202005，含量99.4%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃嘌呤對(duì)照品（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)為X0626，含量≥99.5%）；水蛭胺B 對(duì)照品（批號(hào)為PIMHA - B -20200901-01，含量89.54%），水蛭胺C羧基衍生物對(duì)照品（批號(hào)為PIMHA-C-20200901-01，含量87.46%），均為實(shí)驗(yàn)室自制；甲酸、乙腈均為色譜純，甲醇為分析純；水為超純水。15批螞蟥藥材樣品（相關(guān)信息見表1，均經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 燙螞蟥飲片制備

按2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》［1］“水蛭”項(xiàng)下“燙水蛭”飲片炮制方法，分別取15批螞蟥藥材樣品約100 g，洗凈，切段，干燥，照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0213 炮制通則［10］用滑石粉燙至微鼓起，得對(duì)應(yīng)燙螞蟥飲片（相關(guān)信息見表1）。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為AgilentZorbaxSB-Aq柱（250mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～12 min 時(shí)0%A，12～15 min 時(shí)0%A→1%A，15～27 min 時(shí)1%A→8%A，27～35 min 時(shí)8%A→11%A，35～45 min時(shí)11%A→12%A，45～55 min時(shí)12%A→21%A，55～65 min時(shí)21%A→30%A）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5μL。

質(zhì)譜條件：加熱電噴霧正離子模式（HESI+），鞘氣流速為60 L/min；輔助氣流速為18 L/min；噴霧電壓為2.50 kV；毛細(xì)管溫度為288 ℃；輔助氣溫度為475 ℃；掃描模式為全掃描二級(jí)質(zhì)譜。

2.2.2 溶液制備

取尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、水蛭胺C 羧基衍生物、水蛭胺B 對(duì)照品各適量，精密稱定，加50%甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為135.33，160.20，92.96，34.58，61.82 μg/ mL 的混合對(duì)照品溶液。取藥材/飲片樣品粉末（過3 號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W、頻率40 kHz，下同）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批藥材（編號(hào)MH3）和飲片（編號(hào)TMH3）樣品各適量，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批藥材（編號(hào)MH3）和飲片（編號(hào)TMH3）樣品各適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下分別于0，2，4，6，8，10，18，26 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置26 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批藥材（編號(hào)MH3）和飲片（編號(hào)TMH3）樣品各適量，平行6 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

特征圖譜建立：取藥材、飲片樣品各15 批，分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A 版）對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，分別以編號(hào)為MH1、TMH1的圖譜為參照（因峰形較明顯，峰信號(hào)強(qiáng)度適中；下同），設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用平均數(shù)法進(jìn)行色譜峰匹配，得藥材、飲片樣品的HPLC 疊加指紋圖譜，詳見圖1、圖2；對(duì)照指紋圖譜見圖3、圖4。

圖1 15批藥材樣品的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC chromatograms superimposed fingerprint of 15 batches of medicinal herbs

圖2 15批飲片樣品的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC chromatograms superimposed fingerprint of 15 batches of decoction pieces

圖3 藥材樣品的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.3 HPLC chromatograms reference fingerprint of medicinal herbs

圖4 飲片樣品的高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜Fig.4 HPLC chromatograms reference fingerprint of decoction pieces

共有峰指認(rèn)：取2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，質(zhì)譜分析結(jié)果見圖5、表2。取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，通過比對(duì)2種溶液的保留時(shí)間（tR），最終指認(rèn)出其中峰1-峰5具體成分，色譜圖見圖6。

圖5 總離子流圖Fig.5 Total ion chromatograms

圖6 混合對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of mixed reference solution

表2 質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.2 Results of mass spectrometry analysis

相似度評(píng)價(jià)：分別將30 批藥材/飲片樣品HPLC 特征圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.0 版），分別以編號(hào)為MH1 和TMH1 的圖譜為參照，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 s，采用平均數(shù)法進(jìn)行色譜峰匹配，結(jié)果見表3。所有樣品的相似度均大于0.990，說明不同來源的螞蟥藥材及其對(duì)應(yīng)炮制品的一致性較好。

表3 30批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Results of similarity evaluation of 30 batches of samples

特征圖譜樣品測(cè)定結(jié)果：由圖1、圖2 可知，15 批藥材、飲片樣品分別有8，10 個(gè)共有峰，對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，后者缺失峰7，新增峰9-峰11。峰面積測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 15批藥材及飲片樣品圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab.4 Relative peak area of common peaks in the chromatograms of 15 batches of medicinal herbs and decoction pieces

2.3 聚類分析

將30 批樣品中11 個(gè)特征峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果分類距離為40時(shí)，樣品可聚為兩大類，MH1 - MH15 為一類，均為藥材；TMH1 -TMH15為一類，均為飲片；詳見圖7。聚類結(jié)果與特征圖譜分析結(jié)果一致，均能區(qū)分藥材與飲片。

圖7 藥材及飲片樣品聚類分析結(jié)果Fig.7 Cluster analysis of medicinal herbs and decoction pieces

2.4 主成分分析（PCA）

以30 批樣品中11 個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA，共得到5 個(gè)主成分，其累計(jì)X軸方向模型的累積解釋率［R2X（cum）］為0.95（> 0.90），模型累積預(yù)測(cè)率［Q2（cum）］為0.532（>0.50），說明模型擬合及預(yù)測(cè)能力均較好（見圖8）。基于已得到的5 個(gè)主成分，對(duì)30 批樣品分類（見圖9），主成分分析結(jié)果與聚類分析及特征圖譜分析結(jié)果一致。

圖8 5個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率Fig.8 Cumulative contribution rate of five principal components

圖9 藥材及飲片樣品主成分分析得分圖Fig.9 Scoring plot of principal component analysis of medicinal herbs and decoction pieces

2.5 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

以30 批樣品中11 個(gè)特征峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行判別分析，共得到2 個(gè)主成分，其Y軸方向模型的累積解釋率［R2Y（cum）］為0.965，Q2（cum）為0.94，說明模型的預(yù)測(cè)能力較好（見圖10）。通過20 折置換檢驗(yàn)，得到R2、Q2擬合Y軸的截距分別為0.069 4（<0.3）和-0.343（<0.05），說明模型擬合較好且擬合Y軸的截距為未過度擬合［R2=（0，0.069 4），Q2=（0，- 0.343）；見圖11］。得30 批樣品的得分圖（見圖12），聚類結(jié)果與PCA 分析結(jié)果一致。對(duì)以上變量在預(yù)測(cè)模型中的重要性（VIP）值進(jìn)行分析（見圖13），以VIP 值>1 為限度，得到5 個(gè)貢獻(xiàn)度高的差異性化合物，分別為峰11、峰10、峰7、峰9、峰4（已指認(rèn)），可作為區(qū)分螞蟥藥材與飲片的主要差異成分。

圖10 2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率Fig.10 Cumulative contribution rate of two principal components

圖11 置換驗(yàn)證圖Fig.11 Permutation test

圖12 藥材及飲片樣品得分圖Fig.12 Scoring plot of medicinal herbs and decoction pieces

圖13 變量在預(yù)測(cè)模型中的重要性值圖Fig.13 Variable importance in the projection

2.6 含量測(cè)定

2.6.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察中，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、水蛭胺C 羧基衍生物、水蛭胺B 質(zhì)量濃度分別在0.12～12.41μg/mL，1.20～119.62μg/mL，0.92～92.08μg/mL，1.23～122.90 μg/ mL，1.27～126.83 μg/ mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r>0.999 9，n=5）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于3.0%；表明儀器精密度良好，供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好；平均加樣回收率分別為100.03%，98.37%，92.06%，93.40%，99.93%，RSD分別為2.03%，1.94%，2.61%，1.86%，1.66%（n=6）。

2.6.2 含量測(cè)定結(jié)果

取30 批樣品各適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、水蛭胺C羧基衍生物、水蛭胺B的平均含量，MH1-MH15樣品分別為0.206，1.098，0.721，0.235，0.084 mg/ g，TMH1 - TMH15 樣品分別為0.201，1.229，0.747，0.056，0.074 mg/g。

表5 樣品中5個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.5 Results of content determination of five components in samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中分別考察了乙腈與不同體積分?jǐn)?shù)磷酸二氫鉀、乙酸、磷酸、甲酸溶液組合的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%甲酸水溶液的梯度洗脫程序效果最佳且重復(fù)性好，故本研究中選其作為流動(dòng)相。后采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果各主要成分色譜峰在254 nm 波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)的紫外吸收，故選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 特征圖譜結(jié)果分析

本研究中所選螞蟥為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman的干燥全體，其藥材呈扁平紡錘形，2020年版《中國(guó)藥典》對(duì)其僅通過水分、總灰分、酸堿度等檢查及抗凝血酶活性進(jìn)行質(zhì)量控制，暫未做出不同基源及生品、炮制品間的差異化表征。

本研究中建立了螞蟥藥材及飲片（燙螞蟥）的HPLC特征圖譜，利用質(zhì)譜指認(rèn)出5種成分。其中蝶啶類化合物與氯吡格雷等抗血小板聚集藥有相似結(jié)構(gòu)，認(rèn)為該類成分可能是水蛭發(fā)揮抗血小板聚集的活性成分［11-12］，而水蛭報(bào)道較多的藥理作用主要為抗凝血、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化，且有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、調(diào)血脂等多種藥理活性，說明本研究中所選特征峰對(duì)于闡明水蛭發(fā)揮藥理活性的功效物質(zhì)、促進(jìn)藥物的二次研發(fā)具有重要意義。此外，該方法可用于螞蟥藥材及飲片的化學(xué)特征圖譜表征，如本研究中，飲片雖比藥材缺少1個(gè)特征峰，但新增3個(gè)色譜峰。聚類分析、PCA、PLS-DA 分析均能將兩者分別聚類并有效區(qū)分。PLSDA分析找到5個(gè)區(qū)分兩者的差異標(biāo)志物。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

炮制研究認(rèn)為，滑石粉燙處理的炮制方法在降低其抗凝血酶活性的同時(shí)也減小了毒性［13-14］。李艷玲等［15］通過測(cè)定小鼠的凝血時(shí)間、出血和抗血栓作用發(fā)現(xiàn)，抗凝血效果從強(qiáng)到弱依次為生水蛭的甲醇提取液>燙水蛭的甲醇提取液> 生水蛭的水煎液> 燙水蛭的水煎液；馬琳等［16］通過采用SDS-PAGE 技術(shù)測(cè)定不同水蛭炮制品中水溶性蛋白含量，發(fā)現(xiàn)蛋白含量由多到少依次為凍干水蛭> 生水蛭> 酒制水蛭> 滑石粉燙制水蛭，說明高溫炮制可導(dǎo)致水蛭中蛋白含量降低。

本研究中通過測(cè)定螞蟥藥材及飲片各15 批中5 個(gè)成分含量，發(fā)現(xiàn)炮制前后螞蟥的3個(gè)核苷類化合物含量并無較大差異，而水蛭胺C 羧基衍生物含量明顯降低，水蛭胺B含量無明顯變化。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果可靠，可為螞蟥藥材及其炮制品的區(qū)分及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。同時(shí)，特征圖譜與含量測(cè)定結(jié)果均顯示，與螞蟥藥材比較，飲片中有新成分產(chǎn)生或炮制過程發(fā)生成分轉(zhuǎn)化，螞蟥藥材的炮制及臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。