復方蘆丁片溶出度測定方法的建立及應用*

屈曉萍，屠相土，李 俊

（浙江省臺州市藥品檢驗研究院，浙江 臺州 318000）

復方蘆丁片是由蘆丁（20 mg）、維生素C（50 mg）組成的復方制劑，主要用于治療脆性增加的毛細血管出血癥，也作為高血壓腦病、腦出血、視網膜出血、出血性紫癜、急性出血性腎炎、再發性鼻出血、創傷性肺出血、產后出血等的輔助治療處方藥［1-5］。復方蘆丁片收載于《衛生部藥品標準·化學藥品及制劑（第一冊）》（WS1-68（B）-89），標準中無溶出度檢查項，不能客觀地反映主藥的溶出速率和溶出程度，且處方中蘆丁的水溶性差，故有必要進行溶出度考察。本研究中擬建立復方蘆丁片溶出度的測定方法，并以此考察國內市售產品質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 708DS型溶出度儀（配備850-DS取樣收集系統），Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配備DAD 檢測器和Chemstation 色譜工作站），均購自美國Agilent 公司；CPA225D 型電子天平（賽多利斯< 北京> 有限公司，精度0.01 mg）；SK5200HP 型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

27批復方蘆丁片樣品為2021年浙江省各地區的抽樣樣品（企業a，批號分別為20200530，20200531，20200921，20200922，20201121，20201122，20210112，20210113，20210414；企業b，批號分別為191103，200502，200503，200505，200701，200702，200703，200704，200706，210403；企業c，批號分別為1909N01，2001N09，2004N23，2008N04；企業d，批號分別為181201，210102；企業e，批號分別為2002002，2004002，規格均為每片含維生素C 50 mg、蘆丁20 mg）；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080 -202012，含量91.6%）；十二烷基二甲基氧化胺（LDAO，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為B1911095，含量35%）；甲醇為色譜純，二水磷酸二氫鈉為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：PolyPak C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖溶液（pH 3.0）-甲醇（55∶45，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：259 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成質量濃度為0.44 mg/ mL 的溶液A，精密量取25 mL，置50 mL 容量瓶中，加0.5%LDAO 溶液定容，得溶液B，精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，加0.5%LDAO 溶液稀釋并定容，搖勻，即得蘆丁質量濃度為22μg/mL的對照品溶液。

供試品溶液：取樣品細粉適量（相當于蘆丁11 mg），精密稱定，置500 mL 容量瓶中，加少量甲醇，超聲（200 W、53 kHz，下同）處理10 min，加0.5%LDAO 溶液約300 mL，于熱水中加熱10 min，不斷振搖，使蘆丁完全溶解，冷卻，加0.5%LDAO 定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按復方蘆丁片處方和工藝制備缺蘆丁的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數按蘆丁峰計為10 125，分離度均大于1.5，基線分離良好。陰性對照無干擾峰。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.1.2 項下溶液B 適量，各置50 mL 容量瓶中，加0.5%LDAO 溶液稀釋，制成質量濃度分別為1.103，2.206，4.412，11.03，17.65，22.06，26.47，33.09 μg/ mL 的系列對照品溶液。取適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以蘆丁質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 35.752 2X- 0.173 1（r= 0.999 9，n= 8）。結果表明，蘆丁質量濃度在1.103～33.090 μg/ mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限考察：取2.1.2項下對照品溶液適量，加0.5%LDAO 溶液倍比稀釋，并按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1、3∶1 時的進樣量分別記作定量限、檢測限。結果蘆丁的定量限及檢測限分別為0.180μg/mL及0.055μg/mL。

精密度試驗：取2.1.2 項下對照品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果蘆丁峰面積的RSD為0.71%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.1.2 項下供試品溶液（批號為20200530）適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果蘆丁峰面積的RSD為0.27%（n= 8），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20200530）適量，精密稱定，各6 份，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果蘆丁平均含量為93.25%，RSD為0.46%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20200530）適量，共9份，分別加入低、中、高質量濃度的蘆丁對照品溶液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2 溶出方法確定

2.2.1 轉速確定

取樣品（批號為20200530）適量，以0.6%LDAO 溶液（900 mL）作為溶出介質，轉速為50，75 r/ min，在5，10，15，20，30，45，60，90，120 min時分別取樣，濾過，取續濾液，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量，并繪制溶出曲線（圖2），同時補充等量的溶出介質。結果顯示，50 r/min 條件下，30 min 時蘆丁僅溶出約60%，120 min時仍未到達平臺期；75 r/min 條件下，30 min 時的累積溶出度比前者約高30%，到45 min 時已達平臺期，故選擇轉速為75 r/min。

圖2 不同轉速條件下的溶出曲線Fig.2 Dissolution profiles of samples at different rotational speed

2.2.2 溶出介質體積分數確定

根據溶解度試驗結果，不同濃度LDAO 溶液，蘆丁溶解度及溶出情況均可能不同，參照《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》（簡稱《原則》）推薦的表面活性劑濃度，取復方蘆丁片樣品（批號為20200530）適量，分別以0.3%，0.4%，0.5%，0.6%LDAO溶液900 mL作為溶出介質，轉速為75 r/min，在5，10，15，20，30，45，60，90，120 min時分別取樣，濾過，取續濾液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量，并繪制溶出曲線（圖3），同時補充等量的溶出介質。結果顯示，樣品在0.3%LDAO 溶液中溶出較慢，在0.4%LDAO 溶液中有所增加，而在0.5%和0.6%LDAO 溶液中的溶出情況基本一致，為盡可能接近生理環境，減少表面離子活性劑的濃度，故溶出介質選擇0.5%LDAO溶液。

圖3 不同溶出介質條件下的溶出曲線Fig.3 Dissolution profiles of samples in different mediums

2.2.3 取樣時間確定

選擇溶出曲線中累積溶出度不低于85%且差值小于5%的前2個時間點，取前一時間點為取樣時間點，并將其累積溶出度減去15%作為溶出限［6］。2.2.2 項下溶出曲線中2 個時間點分別為45 min 和60 min，故取樣時間選擇45 min。

2.2.4 管路吸附考察

以0.5%LDAO溶液為溶出介質，轉速為75 r/min時，溶出試驗最后一個取樣點取樣后，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別采用手動取樣和取樣系統自動取樣，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果手動取樣和儀器自動取樣得到的峰面積一致，表明溶出儀和取樣系統的管路對蘆丁均無吸附。

2.3 樣品溶出度考察

取5 家生產企業的7 批樣品各適量，以0.5%LDAO溶液（900 mL）為溶出介質，轉速為75 r/min，在45 min時取樣，經0.45μm 濾膜濾過，取續濾液，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量，并繪制溶出曲線（圖4）。5個企業的27批樣品中，廠家a、d、e的所有批次樣品的平均溶出度均高于75%；廠家b的10批樣品中有8批平均溶出量高于75%，有2 批的溶出度在70%～75%之間，且6片中均有2片低于65%；廠家c的4批樣品平均溶出度均低于70%。

圖4 不同樣品的溶出曲線（n=12）Fig.4 Dissolution profiles of different samples（n=12）

3 討論

3.1 蘆丁測定方法

復方蘆丁片現行質量標準中測定蘆丁含量采用紫外- 可見分光光度法，預試驗中發現樣品中的雜質含量較高，且在362.5 nm 波長處均有較強吸收，故建立HPLC 法測定蘆丁含量，并用于溶出度的測定。結果顯示，輔料和雜質對樣品均無干擾，方法準確可靠，滿足樣品溶出度測定的要求。

3.2 溶出介質

預試驗中，蘆丁在水及pH 1.2，4.0，6.8 的緩沖液中溶解度較低。有文獻顯示，蘆丁在堿性溶液中的溶解度較高［7］；且隨著水溶液的堿性增強蘆丁的溶出度會增大［8］，故采用pH 8.0 磷酸鹽緩沖液作為溶出介質。《原則》要求，采用pH>7.5 溶出介質試驗時應提供充分依據，否則一般不建議采用，且該文獻未考察不同廠家不同批次樣品，故本研究中未采用該方法，而是嘗試采用加入表面離子活性劑的溶液作為溶出介質。

復方蘆丁片每片含蘆丁20 mg，若溶出介質體積為1 000 mL，完全溶解時的質量濃度為20μg/mL，要滿足溶出的漏槽條件［9］，蘆丁的溶解度需不低于100μg/mL。根據蘆丁的溶解度試驗結果，蘆丁在pH 1.2，4.0，6.8的緩沖液、水及不同濃度吐溫中的溶解度均低于該值，均未達到漏槽條件；在0.2%SDS 溶液中的溶解度可達111.9μg/mL，但隨著SDS 體積分數的增加，蘆丁的溶解度增加不明顯，在0.8%SDS 溶液中的溶解度僅為361.3 μg/ mL；添加LDAO 能明顯提高蘆丁的溶解度，0.5%LDAO溶液即能使蘆丁的溶解度達到1 425.6μg/mL。故本研究中選擇含LDAO的溶液作為溶出介質。

3.3 原因分析

根據樣品溶出曲線結果，可知5家生產企業樣品的溶出曲線走勢不完全相同，即采用建立的溶出方法可反映不同生產企業產品之間的溶出行為的差異。對本研究中6 批次樣品溶出度結果較差的原因進行分析可知，企業c 與企業a、企業d 的處方中的輔料種類基本相同，前者僅處方中糊精的用量是后兩者的2 倍以上，具有黏合作用的糊精用量過多會導致崩解變慢，水溶性欠佳的蘆丁因被包裹釋放較慢，故溶出度結果較差，制粒、整粒、壓片等工藝也可能影響樣品的溶出［10-11］；企業b的10批樣品中有2批次溶出度結果較差，原因可能與混合、總混等工藝不穩定有關，說明該企業生產工藝的穩定性仍有待提高。

綜上所述，本研究中所建立的方法專屬性強，精密度、穩定性、重復性和準確度好，能反映國內不同企業復方蘆丁片的質量差異。