一測多評法同時(shí)測定結(jié)石通片中7 種成分含量

聶 溶，蔡林雪，孟倩穎

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350000）

結(jié)石通片由廣金錢草、石韋、玉米須、車前草、茯苓、雞骨草、白茅根、海金沙草8 味藥材組方，具有清熱利濕、通淋排石、鎮(zhèn)痛止血功效，臨床用于治療泌尿系統(tǒng)感染、尿路結(jié)石、血尿、腎炎水腫等病癥［1］。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有廣金錢草的薄層色譜鑒別項(xiàng)及片劑通則檢查項(xiàng)，且文獻(xiàn)報(bào)道僅對有效成分綠原酸進(jìn)行了定量控制［2］，難以全面評價(jià)該制劑的質(zhì)量。一測多評（QAMS）法能通過建立相對易得且穩(wěn)定成分與其他組分之間的相對較正因子（RCF），同步實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)含量測定［3-4］。2020 年版《中國藥典（一部）》收錄了咳特靈膠囊、銀杏葉滴丸等中成藥含量測定的QAMS 法［5］，亦有研究采用QAMS 法評價(jià)中藥制劑質(zhì)量［6-8］。本研究中采用QAMS 法同時(shí)測定結(jié)石通片中7 種成分的含量，以期為提升該制劑的質(zhì)量提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司，配有2689 型VWD 紫外檢測器）；XP505 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01mg）；KQ -500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

結(jié)石通片（陜西康惠制藥股份有限公司，批號分別為20211019，20211126，20211222，220314，220507，220620）；夏佛塔苷對照品（批號為111912-202204，含量94.9%），綠原酸對照品（批號為110753-202119，含量96.3%），芒果苷對照品（批號為111528-202210，含量96.6%），大車前苷對照品（批號為11557 - 202003，含量98.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；異夏佛塔苷對照品（批號為TT20022384，含量92.8%），異牡荊苷對照品（批號為TT2108367，含量97.6%），茯苓酸對照品（批號為TT2205121，含量99.1%），均購自上海同田生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 0.15%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時(shí)12%A →26%A，20～30 min 時(shí)26%A →35%A，30～38 min 時(shí)35%A，38～44 min 時(shí)35%A →40%A，44～55 min 時(shí)40%A →85%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm（0～44 min時(shí)，夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、綠原酸、芒果苷、大車前苷），210 nm（44～55 min時(shí)，茯苓酸）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL［9-11］。

2.2 溶液制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇，制成夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、綠原酸、芒果苷、大車前苷、茯苓酸質(zhì)量濃度分別為0.386 1，0.131 4，0.292 4，0.512 8，0.403 7，0.228 5，0.230 9 mg/mL 的混合對照品貯備液；精密量取樣品2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液，室溫避光貯藏。取樣品10片，除去包衣，研勻，取1.0 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇85 mL，超聲（功率450 W、頻率40 kHz，下同）處理45 min，放冷，加75%甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，室溫避光貯藏。按結(jié)石通片處方及工藝，分別制備缺廣金錢草、石韋、玉米須、車前草、茯苓的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備各陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果理論板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均大于3 500，分離度均大于1.5；陰性對照均無干擾，表明專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下混合對照品貯備液0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別加甲醇制成系列混合對照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.1 Results of methodological investigation

檢測限與定量限考察：取2.2 項(xiàng)下對照品溶液適量，用甲醇逐級稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）約為3∶1、10∶1時(shí)待測成分的質(zhì)量濃度為檢測限和定量限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。取同一批供試品溶液（批號為220314）適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，連續(xù)3 d，每日進(jìn)樣3 次。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），詳見表1，表明儀器日內(nèi)精密度良好，方法日間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)；取同一批（批號為220314）供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，15，20，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），詳見表1。表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)；取同一批（批號為220314）樣品適量，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），詳見表1。表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號為220314）0.5 g，平行6 份，精密稱定，置棕色容量瓶中，加入混合對照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.4 RCF 測定

取線性關(guān)系考察項(xiàng)下系列混合對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖及峰面積。以綠原酸為內(nèi)參物，按公式RCFk/s=（Ck×As）/（Cs×Ak）計(jì)算（其中，C 為質(zhì)量濃度，A 為峰面積，k 指其他6 種待測成分之一，s指內(nèi)參物）。結(jié)果見表2。

表2 6種成分的相對校正因子（n=6）Tab.2 RCFs of six components（n=6）

2.5 RCF 耐用性考察

色譜儀和色譜柱：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件，采用2 種高效液相色譜儀（Waters e2695型和Agilent 1260型）和3種色譜柱（Thermo Scientific Acclaim 160 C18柱、Waters SunFire C18柱及Agilent ZORBAX SB C18柱，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5μm）分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算RCF。結(jié)果夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、芒果苷、大車前苷和茯苓酸的平均RCF 分別為1.333，1.673，1.948，1.953，1.257，1.350，RSD分別為1.74%，1.07%，1.16%，1.05%，1.36%，1.58%。表明色譜儀、色譜柱發(fā)生一定變化時(shí)本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

柱溫：取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件，采用不同柱溫（25，30，35 ℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算RCF。結(jié)果夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、芒果苷、大車前苷和茯苓酸的平均RCF 分別為1.325，1.667，1.964，1.938，1.253，1.341，RSD分別為1.14%，0.94%，1.12%，0.88%，1.54%，1.09%（n= 3），表明柱溫發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.6 QAMS 法與外標(biāo)（ESM）法測定結(jié)果比較

取6 批樣品各適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行3 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄夏佛塔苷、異夏佛塔苷、異牡荊苷、綠原酸、芒果苷、大車前苷、茯苓酸的峰面積，分別采用ESM 法和QAMS 法計(jì)算各成分含量，組間比較行t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，2 種測定方法的結(jié)果無顯著差異（P>0.05）。詳見表3。

表3 樣品中7種成分一測多評法和外標(biāo)法含量測定結(jié)果比較（mg/g，n=3）Tab.3 Comparison of content determination of seven components in samples by QAMS and ESM（mg/g，n=3）

3 討論

結(jié)石通片中廣金錢草清熱利尿、通淋利濕，為君藥；石韋利尿通淋、涼血止血，車前草清熱利尿、通淋止痛，茯苓淡滲利濕、通利膀胱，共為臣藥；玉米須利尿通淋，為佐藥；雞骨草、白茅根、海金沙草清熱利尿解毒，共為使藥。研究表明，廣金錢草中藥效成分主要為夏佛塔苷、異夏佛塔苷黃酮類化合物和綠原酸酚酸類化合物［12］；石韋中芒果苷屬雙苯吡酮類化合物，具有利尿護(hù)腎、抗炎等作用［13］；車前草中大車前苷屬苯乙醇苷類化合物［14-15］，具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，是2020 年版《中國藥典（一部）》中評價(jià)車前草質(zhì)量的代表性成分；茯苓主要藥效成分為三萜類和多糖類，三萜類中茯苓酸含量較高，具有利尿、促進(jìn)神經(jīng)伸展等作用［16］；玉米須中主要藥效成分為黃酮類成分異牡荊苷［17］。因所需對照品品種多、價(jià)格昂貴，且不易獲得，在日常檢驗(yàn)中較難同時(shí)測定7種成分含量，故采用QAMS 法，以綠原酸為內(nèi)參物，測定其余6 種成分的RCF，并計(jì)算含量，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)石通片的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)。

QAMS法和ESM法的測定結(jié)果差異不明顯，提示本研究中所建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確，可用于結(jié)石通片的多種有效成分的含量測定。但目標(biāo)成分含量存在一定的批間差異，如芒果苷含量為0.611～0.700 mg/ g，異夏佛塔苷含量為0.200～0.257 mg/g，可能與制劑的原藥材產(chǎn)地、采收、加工等有關(guān)，故建立多指標(biāo)成分評價(jià)模式有助于確保結(jié)石通片質(zhì)量的穩(wěn)定。

綜上所述，本研究中建立了同時(shí)測定結(jié)石通片中7 種成分含量的QAMS 法，且操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于結(jié)石通片多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制，繼而為全面評價(jià)該制劑質(zhì)量提供參考。