禽噬菌體分離及效果評價(jià)

成華初，文進(jìn)權(quán)，李建軍，朱 玲，潘延缽

（1.常德市鼎城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 常德 415101；2.常德市鼎城區(qū)中河口鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合站，湖南 常德 415121；3.常德市鼎城區(qū)堯天坪鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，湖南 常德 415129；4.湖南瑞陽瑞泰生物科技有限公司，湖南 常德 415106）

禽大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌所引起的局灶性和全身性感染的疾病[1]；禽沙門氏菌病是由沙門氏菌屬中的任何一個(gè)或多個(gè)成員所引起的禽類的急性或慢性疾病的總稱[2]，是可以引起局部或全身感染和慢性無癥狀攜帶者狀態(tài)的兼性胞內(nèi)病原體[3]。這兩種病的發(fā)生均能引起蛋雞產(chǎn)軟殼蛋、沙殼蛋、糊肛甚至死亡。隨著近年來畜禽業(yè)的快速發(fā)展與推廣，致病性大腸桿菌與沙門氏菌給動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失越來越大。致病性大腸桿菌病具有難以治愈，死亡率高，極易復(fù)發(fā)等臨床特點(diǎn)；而沙門氏菌則能夠?qū)е滦笄莩Ｒ姸喟l(fā)病的發(fā)生。畜禽一旦發(fā)病，大多是使用抗生素來進(jìn)行防治。抗生素治療有著幾十年的有效治療歷史，但隨著越來越多耐/抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，細(xì)菌對抗生素的抗藥性已成為一個(gè)大問題[4]。為解決這一問題，研發(fā)出一款非抗生素類制劑已迫在眉睫。

噬菌體療法被應(yīng)用于臨床抗細(xì)菌感染治療有著100多年的歷史[5]，早在20世紀(jì)30年代就有噬菌體成功治療霍亂的報(bào)道[6]。其作為一類可以感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，具有特異性強(qiáng)，僅針對目標(biāo)宿主菌，對周圍其他菌株無影響，當(dāng)目標(biāo)宿主菌被殺死后衰減并被清除的抗生素所沒有的優(yōu)勢。有研究證明噬菌體對動(dòng)物和人體是安全的[7-8]，且噬菌體是一種極具潛力的抗菌劑來源[9]，將其作為一種天然綠色、安全有效的抗生素替代品，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株

大腸桿菌RYE01、RYE02、RYE04、RYE07由湖南瑞陽瑞泰生物科技有限公司分離保存及供應(yīng)。噬菌體RPE01P、RPE02P、RPE04P、RPE07P由湖南瑞陽瑞泰生物科技有限公司分離保存及供應(yīng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

麥康凱培養(yǎng)基、ss培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、5%甘油。

超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫氣浴振蕩器、立式壓力蒸汽滅菌鍋、高速離心機(jī)、蠕動(dòng)泵、超低溫冰箱。

1.2 宿主菌的分離與保存

以無菌操作的方法將病死雞肝臟樣品分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取疑似大腸桿菌/沙門氏菌菌落接種于營養(yǎng)瓊脂/TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落于液體培養(yǎng)基，混合均勻，恒溫氣浴振蕩器37℃170rpm培養(yǎng)至液體變渾濁。5%甘油分裝2～3支ep管1ml/管，編號，-80℃超低溫冰箱保存。

1.3 噬菌體的分離與保存

1.3.1 雞場糞便污水處理

取雞場糞便、土壤、污水樣品混合均勻靜置5min，紗布過濾，離心機(jī)6000rpm離心6min，留上清并重復(fù)離心3次，最終上清用注射器與0.45μm濾器過濾于燒杯備用。

1.3.2 噬菌體的分離與保存

吸取0.1ml宿主菌于3ml/管液體培養(yǎng)基各兩支（一支為菌株組，一支為噬菌體組），恒溫氣浴振蕩器37℃ 170rpm培養(yǎng)至渾濁。以無菌操作的方法用注射器與0.22μm濾器過濾0.3ml備用上清于噬菌體組，繼續(xù)培養(yǎng)6～12h，液體變澄清即分離到噬菌體。吸取噬菌體1ml/管于2～3支ep管，編號，-80℃超低溫冰箱保存。

1.4 噬菌體制劑的制備

1.4.1 菌種復(fù)蘇

取出并解凍大腸桿菌RYE01、RYE02、RYE04、RYE07，噬菌體RPE01P、RPE02P、RPE04P、RPE07P。無菌條件下用接種環(huán)接種大腸桿菌于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落于3ml/管的液體培養(yǎng)基，恒溫氣浴振蕩器37℃170rpm培養(yǎng)至渾濁。吸取0.1ml菌液于3ml/管液體培養(yǎng)基各兩支（一支為菌株組，一支為噬菌體組），恒溫氣浴振蕩器37℃170rpm培養(yǎng)至渾濁，噬菌體組中加入經(jīng)注射器與0.22μm濾器過濾的噬菌體液體，培養(yǎng)至液體變澄清，得到復(fù)蘇后的噬菌體與大腸桿菌。

1.4.2 制備噬菌體生物制劑

吸取0.1ml菌液于100ml/瓶的液體培養(yǎng)基，恒溫氣浴振蕩器37℃170rpm培養(yǎng)至渾濁，加對應(yīng)噬菌體上清，繼續(xù)培養(yǎng)至澄清，倒入離心管7000rpm離心8min備用。吸取0.6ml菌液于600ml/瓶的液體培養(yǎng)基中，恒溫氣浴振蕩器37℃170rpm培養(yǎng)至渾濁，加入約50ml備用上清，繼續(xù)培養(yǎng)至澄清。離心機(jī)7000rpm離心8min，倒上清于容器，混合均勻。無菌條件下0.22μm濾膜過濾裝瓶。

1.5 噬菌體防治蛋雞大腸桿菌沙門氏菌病臨床試驗(yàn)

選取兩棟整體情況相近的雞舍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，一組為實(shí)驗(yàn)組A 15000羽/100ml噬菌體制劑飲水投藥，連用9d；另一組為對照組B正常飲水。從喂藥前三天開始觀察并記錄雞群整體狀態(tài)（精神狀態(tài)、采食量、蛋質(zhì)、雞糞情況等）并連續(xù)統(tǒng)計(jì)以下指標(biāo)共12d。糊肛率：每組選5個(gè)采樣點(diǎn)，每點(diǎn)各100只雞，統(tǒng)計(jì)糊肛量與糊肛率；死淘率：統(tǒng)計(jì)各組死淘量與死淘率；產(chǎn)蛋率：統(tǒng)計(jì)各組產(chǎn)蛋量與產(chǎn)蛋率。

2 結(jié)果與分析

2.1 宿主菌以及噬菌體的分離與保存

從病死雞肝臟樣品中分離保存并鑒定了5株大腸桿菌，8株沙門氏菌，并從雞場糞便、土壤、污水樣品中分離并保存了每株菌相應(yīng)的噬菌體，保存于湖南瑞陽瑞泰生物科技有限公司。

2.2 噬菌體生物制劑的制備

按1.4所述方法分別對各株噬菌體進(jìn)行培養(yǎng)與制備，最終獲得4.9L噬菌體制劑。

2.3 噬菌體防治蛋雞大腸桿菌沙門氏菌病臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)

通過對養(yǎng)殖場各棟雞舍生產(chǎn)數(shù)據(jù)以及雞群健康狀況對比后，選取各項(xiàng)數(shù)據(jù)接近的B4與B3兩棟雞舍內(nèi)雞群進(jìn)行試驗(yàn)分組，將B4棟雞舍內(nèi)雞群作為實(shí)驗(yàn)組A（用藥組），將B3棟雞舍內(nèi)雞群作為實(shí)驗(yàn)組B（對照組）實(shí)驗(yàn)期間，其他藥物均停止使用。

2.3.1 A、B兩組雞群整體狀態(tài)觀察

喂藥前3d，兩組整體精神狀態(tài)與采食量一般，蛋質(zhì)較差，軟殼蛋、沙殼蛋較多、糞便較稀。喂藥7d后兩組整體精神狀態(tài)與采食量一般；A組蛋質(zhì)變好、軟殼蛋與沙殼蛋減少、蛋殼較光滑、蛋重稍增加、雞糞較干，較B組變化較大。喂藥9d后A組較B組蛋質(zhì)、雞糞更好。

2.3.2 A、B兩組采樣點(diǎn)糊肛率統(tǒng)計(jì)

噬菌體制劑可以有效降低蛋雞糊肛率。A組從投藥第4d開始糊肛率明顯下降，第5d開始未見糊肛；B組糊肛率基本保持在1.2%～1.4%左右，未見下降，見表1。

表1 A、B兩組采樣點(diǎn)糊肛率統(tǒng)計(jì)表

2.3.3 A、B兩組死淘率統(tǒng)計(jì)

噬菌體制劑能減少蛋雞死淘率。A組從投藥第5d起死淘率較B組低，B組死淘率一直呈上下浮動(dòng)狀態(tài)，見表2。

表2 A、B兩組死淘率統(tǒng)計(jì)表

2.3.4 A、B兩組產(chǎn)蛋率統(tǒng)計(jì)

噬菌體制劑對提高蛋雞產(chǎn)蛋率未有明顯成效見表3。

表3 A、B兩組產(chǎn)蛋率統(tǒng)計(jì)表

3 討論與結(jié)論

近幾年，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，細(xì)菌性的疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的損失是不可忽略的。其中雞的致病性大腸桿菌病與沙門氏菌病幾乎伴隨雞生長、繁殖、生產(chǎn)的一生，并嚴(yán)重影響和制約著我國養(yǎng)雞水平的上升。對致病雞群的防治措施不全面、不正確，僅靠大劑量的抗生素控制，導(dǎo)致雞的生產(chǎn)及產(chǎn)品檢測中含有大量病殘、藥殘，影響我國雞產(chǎn)品的出口及人類的身體健康。噬菌體是一種能侵襲細(xì)菌的病毒，其廣泛存在于自然界中，據(jù)統(tǒng)計(jì)分析其數(shù)量可以達(dá)到1031[10]。早7在20世紀(jì)初，噬菌體治療就取得了積極的治療效果[11]。臨床應(yīng)用上，噬菌體的宿主范圍比抗生素窄，這種有限的宿主范圍對疾病的治療非常有利。抗生素治療通常會(huì)影響腸道菌群，但噬菌體療法對胃腸道菌群與體內(nèi)生態(tài)的影響比抗生素治療要小得多。可見噬菌體療法在防治細(xì)菌性疾病與代替抗生素治療疾病方面具有廣大前景。

通過對兩組雞群用藥前后整體狀態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)本研究所制備的噬菌體生物制劑可以提高蛋質(zhì)與蛋重、減少沙殼蛋與軟殼蛋、改善雞群拉稀、減少糊糞蛋、使蛋表面光滑（雞群的整體狀態(tài)觀察）；在降低蛋雞糊肛率方面具有良好的防治效果（表1）；在減少蛋雞死亡率方面具有較好的防治效果（表2）；在提高產(chǎn)蛋率方面未見成效（表3）。

本實(shí)驗(yàn)通過從病死雞肝臟樣品中分離致病性大腸桿菌及沙門氏菌作為宿主菌，添加雞場糞水過濾上清分離培養(yǎng)相應(yīng)噬菌體，與本實(shí)驗(yàn)室之前所分離保存的較廣譜噬菌體進(jìn)行擴(kuò)培、混合過濾來制作噬菌體制劑。通過設(shè)計(jì)蛋雞致病性大腸桿菌沙門氏菌臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證了該噬菌體制劑能改善雞蛋品質(zhì)、減少糊肛率與死淘率，在蛋雞致病性大腸桿菌沙門氏菌感染上具有良好防治效果。說明該款制劑能改善雞群的腸道菌群，殺死致病性大腸桿菌及沙門氏菌，但由于雞群體內(nèi)含有別的致病菌，故導(dǎo)致對死淘率的改善低于糊肛率。而產(chǎn)蛋率未有明顯變化，則可能是處于秋冬換季期。