越橘花青素提取工藝優(yōu)選及樹脂純化工藝研究

劉 梅，郝長偉

（1.東營市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東 東營 257335；2.包頭東寶生物技術(shù)股份有限公司，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

花青素（Anthocyanin）又稱花色素、花色苷，屬于生物類黃酮物質(zhì)，是一種廣泛存在于植物中的天然色素。花青素具有很強的生物活性，可發(fā)揮抗氧化、清除自由基、緩解視力疲勞、預(yù)防阿爾茨海默病等作用，已成為近年來的研究熱點[1-2]。相對于化學(xué)制劑，天然成分安全性更高，備受人們青睞。如何簡化天然成分提純工藝、降低成本、提高收率已成為研究者關(guān)注的熱點問題?；诖?，本試驗對越橘花青素提取工藝和純化工藝進(jìn)行研究，確定最佳工藝參數(shù)，為越橘花青素的后續(xù)開發(fā)利用提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

越橘果：經(jīng)鑒定為杜鵑花科越橘屬（Vaccinium Spp）漿果類植物果實，低溫貯藏備用。試劑：濃鹽酸；甲醇（分析純），無水乙醇，飛燕草素對照品（純度≥97%），氫氧化鈉（分析純），鹽酸（分析純），95% 乙醇（分析純），水（超純水），大孔樹脂（D101，AB-8，DA201-C）。

1.2 儀器和設(shè)備

AB204-S 型電子分析天平（德國Sartorius），HH-S8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司），Alpha-1900S 雙光束掃描型紫外可見分光光度計（上海譜元儀器有限公司），GT10-1 型高速臺式離心機（河北醫(yī)眾醫(yī)療器械有限公司），冷凍干燥機（上海繼譜電子科技有限公司），SHB-IIIS 型臺式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），N-1300V-WB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社），CHA-SA 空氣浴振蕩器（常州市國旺儀器制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料前處理 挑選成熟度均一的越橘果，清洗、瀝干表皮水分、打漿，置于冷凍干燥機中預(yù)凍4 h，凍干36 h，粉碎，過80 目篩，制成越橘凍干粉，于-10 ℃密封避光保存?zhèn)溆肹3]。

1.3.2 供試品溶液制備[3]取越橘凍干粉5 g，精密稱定，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入一定體積和確定pH 值的乙醇溶液，置于預(yù)先設(shè)定好的水浴溫度下浸提一段時間。提取結(jié)束后，將提取液倒入離心管中，置于冷凍離心機中離心10 min，轉(zhuǎn)速為4000 r/min。取1 mL 上清液置于100 mL 棕色容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇稀釋至適量，置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min，冷卻。加2% 鹽酸- 甲醇稀釋至刻度線，搖勻，取1 mL置于100 mL 棕色容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇定容，搖勻、濾過，即為供試品溶液，備用。

1.3.3 吸光度的測定 精密稱取飛燕草素對照品5 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入2% 鹽酸- 甲醇定容至刻度線，搖勻，精密稱取1 mL 置于25 mL 容量瓶中，用2% 鹽酸- 甲醇定容稀釋，搖勻，即為對照品溶液，備用。精密稱取飛燕草素對照品溶液，加2% 鹽酸-甲醇制成飛燕草素質(zhì)量濃度分別為1.10 μg/mL、3.31 μg/mL、5.52 μg/mL、6.62 μg/mL、8.83 μg/mL的對照品溶液。以2% 鹽酸- 甲醇溶液為空白，采用紫外可見分光光度法，于540 nm 波長處測定吸光度。以飛燕草素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.1002x+0.0172，R2=0.9995，線性關(guān)系良好。以2% 鹽酸- 甲醇作為空白試劑，取供試品溶液適量，于540 nm 波長處測定吸光度，計算樣品中飛燕草素質(zhì)量濃度?；ㄇ嗨氐暮恳燥w燕草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)計，花青素提取率（%）=

1.3.4 單因素實驗

1.3.4.1 乙醇濃度 稱取越橘凍干粉5 g，置于100 mL容量瓶中，分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，按1.3.2 項下操作，測定吸光度，確定最佳提取乙醇濃度。

1.3.4.2 料液比 稱取越橘凍干粉5 g，置于100 mL 容量瓶中，按料液比為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50分別加入60%的乙醇，按1.3.2 項下操作，測定吸光度，確定最佳料液比。

1.3.4.3 提取溫度 稱取越橘凍干粉5 g，置于100 mL容量瓶中，加入60% 的乙醇，分別于35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃下浸提，按1.3.2 項下操作，測定吸光度，確定最佳提取溫度。

1.3.4.4 提取時間 稱取越橘凍干粉5 g，置于100 mL容量瓶中，加入60% 的乙醇，分別浸提30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，按1.3.2 項下操作，測定吸光度，確定最佳提取時間。

1.3.5 正交試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)置乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間4 個因素，設(shè)計L9（34）正交試驗，重復(fù)3 次，篩選出提取越橘花青素的最佳提取工藝，正交試驗因素水平設(shè)計表見表1。

表1 越橘花青素提取條件正交試驗因素水平設(shè)計表

1.3.6 純化工藝研究

1.3.6.1 大孔樹脂預(yù)處理 稱取一定量的大孔樹脂，置于95% 乙醇中浸泡24 h，用蒸餾水沖洗至pH 值為中性。用2 ～3 倍樹脂體積的NaOH 溶液（0.1 mol/L）浸泡5 h，用蒸餾水洗至pH 值為中性。用2 倍樹脂體積的HCL 溶液（0.1 mol/L）浸泡5 h，用蒸餾水洗至pH 值為中性，備用。

1.3.6.2 花青素提取液的處理 取一定量最佳工藝條件下提取的花青素提取液，減壓濃縮，倒入離心管中，置于冷凍離心機中離心10 min，轉(zhuǎn)速為4000 r/min，取上清液，加蒸餾水稀釋后備用。

1.3.6.3 樹脂型號的選擇 備選出三種樹脂型號，分別為AB-8、D101、DA201-C。精確稱取三種樹脂各20.00 g，置于錐形瓶中，各加入50 mL 花青素提取液，密封，放入恒溫?fù)u床（溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min）振蕩5 h。分別測定3 種型號大孔樹脂吸附花青素提取液的吸光值A(chǔ)1，并計算吸附率。精確稱取已吸附花青素的三種樹脂各20.00 g，分別置于錐形瓶中，用蒸餾水沖洗，各加入80% 乙醇溶液50 mL，密封，置于恒溫?fù)u床（溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min）振蕩5 h。分別測定解析后液體的吸光度A2，并計算解吸率。

1.3.6.4 花青素提取液pH 值的選擇 取適量花青素提取液5 份，加入鹽酸，使pH 值分別為1.0、1.5、2.0、

2.5、3.0，分別測定吸光度A0。進(jìn)行動態(tài)吸附試驗，上樣流速為1.0 mL/min，通過吸光度A 的變化計算出吸附率。

1.3.6.5 吸附時間的選擇 精密稱取5 g 已預(yù)處理的D101 樹脂，置于100 mL 錐形瓶中，加入花青素提取液50 mL，封口后置于轉(zhuǎn)速120 r/min 的振蕩器中振蕩，每隔1 h 測定吸光度A，記錄12 h 內(nèi)花青素吸光度A的變化，計算吸附率。

1.3.6.6 洗脫速率的選擇 精密稱取5 份預(yù)處理好的D101 樹脂，每份5 g，濕法裝柱，樹脂體積大約10 mL，加入花青素提取物（濃度為3.81 mg/mL），控制流速為1 mL/min，上樣體積為5 BV，待樣液全部通過樹脂后，加蒸餾水洗脫至無色，加入80% 乙醇50 mL進(jìn)行動態(tài)洗脫，分別控制洗脫速率為0.5 BV/h、1.0 BV/h、1.5 BV/h、2.0 BV/h、2.5 BV/h，通過吸光度A的變化計算解吸率。

1.3.6.7 乙醇濃度的選擇 精密稱取5 份已吸附花青素的飽和樹脂，各40.00 g，用蒸餾水沖洗，分別加入乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90% 的酸性乙醇溶液洗脫柱子，進(jìn)行動態(tài)解析試驗，控制速率為1.0 BV/h，通過吸光度A 的變化計算解吸率。

1.3.6.8 洗脫液pH 值的選擇 精密稱取5 份已吸附花青素的飽和樹脂，各40.00 g，用蒸餾水沖洗，分別加入pH 值為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 的乙醇溶液洗脫柱子，進(jìn)行動態(tài)解析試驗，控制洗脫速率為1.0 BV/h，通過吸光度A 的變化計算解吸率。

2 試驗結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對越橘花青素提取率的影響 由圖1 可知，隨著乙醇濃度的增加，越橘花青素提取率整體呈現(xiàn)先增后降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50% 時，越橘花青素提取率達(dá)到最高，為55.43%。根據(jù)相似相溶原則，50% 乙醇極性與越橘花青素極性相似，越橘花青素提取率最大，隨著乙醇濃度的增加，乙醇極性發(fā)生變化，越橘花青素含量降低，故確定50% 乙醇為提取越橘花青素的最佳溶劑。

圖1 乙醇濃度對越橘花青素提取率的影響

2.1.2 料液比對越橘花青素提取率的影響 如圖2 所示，隨著料液比的增加，提取溶劑與越橘凍干粉接觸面積增大，促進(jìn)越橘花青素的溶出。當(dāng)料液比為1:30 時，到達(dá)飽和狀態(tài)，此時越橘花青素提取率為58.11%。繼續(xù)增加料液比，越橘花青素提取率降低，可能是由于料液比過大導(dǎo)致色素濃度稀釋，色素分子間作用力減小，使越橘花青素穩(wěn)定性降低，從而導(dǎo)致部分花青素分解[4]。此外，持續(xù)增加料液比易使雜質(zhì)產(chǎn)生，并且造成物料浪費，故選擇1:30 作為最佳料液比。

圖2 料液比對越橘花青素提取率的影響

2.1.3 提取溫度對越橘花青素提取率的影響 如圖3 所示，當(dāng)溫度為35 ℃～55 ℃時，越橘花青素并不穩(wěn)定，提取率在55%～57%之間。當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃時，越橘花青素含量最高，此時提取率為59.63%。研究表明，花青素的穩(wěn)定性和溫度有關(guān)，高溫不易造成花青素糖苷水解[5]。故選擇65 ℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對越橘花青素提取率的影響

2.1.4 提取時間對越橘花青素提取率的影響 如圖4 所示，在一定提取時間內(nèi)，越橘花青素提取率呈現(xiàn)先增后降的趨勢。提取時間為60 min 時，越橘花青素提取率高達(dá)58.08%。60 min 后，越橘花青素含量逐漸減少，這可能與空氣氧化、溶解飽和、產(chǎn)生雜質(zhì)以及花青素?zé)岱€(wěn)定性有關(guān)[3]。故選擇60 min 作為最佳提取時間。

圖4 提取時間對越橘花青素提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

通過正交試驗和方差分析表明，諸因素對試驗結(jié)果影響的主次順序為A ＞B ＞D ＞C，即乙醇濃度影響因素最大，其次為料液比，提取溫度和時間影響較小，故A2B2C2D2 組合最佳，即乙醇濃度為50%，料液比為1:30，提取溫度為65 ℃，提取時間為60 min。試驗數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 越橘花青素提取正交試驗結(jié)果

2.3 純化工藝研究結(jié)果

2.3.1 不同樹脂型號對越橘花青素吸附率和解吸率的影響 如表3 所示，三個型號（AB-8、D101、DA201-C）樹脂對越橘花青素吸附率影響的主次順序為DA201-C ＞D101 ＞AB-8；三個型號樹脂對越橘花青素解吸率影響的主次順序為D101 ＞AB-8 ＞DA201-C。根據(jù)吸附率和解吸率綜合考慮，采用D101 型號樹脂作為吸附材料。

表3 不同樹脂型號越橘對花青素吸附率和解吸率的影響

2.3.2 不同pH 值越橘花青素提取液對D101 樹脂吸附的影響 從圖5 可知，不同pH 值的越橘花青素提取液對D101 樹脂的吸附能力有一定的影響，當(dāng)上樣樣品pH 值為1.5 時，此時該樹脂吸附越橘花青素的能力最強，吸附率達(dá)到65.94%，故將上樣樣品pH 值定為1.5。

圖5 不同pH 值越橘花青素提取液對D101 樹脂吸附的影響

2.3.3 不同吸附時間對D101 樹脂吸附的影響 從圖6可知，D101 大孔樹脂對越橘花青素的吸附率隨著吸附時間的延長而增大。當(dāng)吸附時間為3 h 時，該樹脂對越橘花青素的吸附率達(dá)到92.69%，繼續(xù)延長吸附時間，D101 樹脂對越橘花青素的吸附率上升減慢，到12 h 時 吸 附 率 達(dá) 到93.46%。表 明 吸 附3 h 后，D101 樹脂已接近飽和狀態(tài)，故選擇3 h 為最佳吸附時間。

圖6 不同吸附時間對D101 樹脂吸附的影響

2.3.4 不同洗脫速率對D101 樹脂解吸率的影響 從圖7 可知，當(dāng)洗脫速率為1 BV/min 時，D101 樹脂的解吸率出現(xiàn)峰值，解吸率為92.21%，繼續(xù)加快洗脫速率，越橘花青素解吸率逐漸降低，故選擇1 BV/min 為洗脫速率。

圖7 不同洗脫速率對D101 樹脂解吸率的影響

2.3.5 不同乙醇濃度對D101 樹脂解吸率的影響 從圖8 可知，D101 樹脂解吸能力隨著乙醇濃度的增大而增強，當(dāng)乙醇濃度為80% 時，D101 樹脂對越橘花青素的解吸能力最強，解吸率為88.76%，故選擇80% 乙醇作為洗脫劑。

圖8 不同乙醇濃度對D101 樹脂解吸率的影響

2.3.6 不同pH 值洗脫液對D101 樹脂解吸率的影響從圖9 可知，D101 樹脂解吸能力隨著洗脫液pH 值的增加而下降，故選擇洗脫液pH 值為1.0。

圖9 不同pH 值洗脫液對D101 樹脂解吸率的影響

2.3.7 純化工藝結(jié)果考察 根據(jù)上述試驗結(jié)果，確定最佳純化工藝為：上樣液pH 為1.5，吸附時間為3 h，洗脫液為80% 乙醇，洗脫液pH 為1.0，洗脫速率為1 BV/h。

2.3.8 工藝驗證試驗結(jié)果 根據(jù)最佳純化工藝條件，進(jìn)行3 次驗證試驗，結(jié)果表明該工藝條件穩(wěn)定可行。試驗數(shù)據(jù)詳見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果（%）

3 討論

花青素是一種水溶性黃酮類色素，易溶于水、乙醇、丙酮等溶劑。由于水的極性太大，提取花青素時易產(chǎn)生雜質(zhì)，同時丙酮毒性過大，且價格較高，故本試驗選擇安全低毒、價格成本較低的乙醇作為提取溶劑。花青素的穩(wěn)定性受本身結(jié)構(gòu)和外界環(huán)境等因素的影響，尤其對pH 值、溫度、光照、金屬離子、氧化劑等因素敏感。在提取工藝優(yōu)化的過程中，乙醇濃度和提取溫度對花青素提取率的影響變化明顯，尤其是隨著乙醇濃度的增加，花青素提取率逐漸出現(xiàn)峰值，繼續(xù)增加乙醇濃度，花青素提取率則變化不規(guī)律。在提取過程中，要依據(jù)相似相溶原理，從氧化、溶劑飽和、雜質(zhì)等多方面考慮，選擇最佳的提取工藝參數(shù)。

越橘經(jīng)提取后，提取液中除花青素外，還存在大量淀粉、膠質(zhì)等物質(zhì)，對其后續(xù)的穩(wěn)定性有影響，因此，我們進(jìn)一步對花青素提取液純化。文獻(xiàn)[6]表明，目前花青素分離純化的方法有：膜分離法、柱層析法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法，其中應(yīng)用大孔樹脂對花青素柱層析是純化花青素的主要方法。大孔樹脂操作簡單，可再生重復(fù)利用，并且試驗成本較低，故本試驗以越橘花青素吸附率和解吸率為指標(biāo)，對大孔樹脂型號及具體步驟參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化選擇，確定最佳純化工藝。另外，本試驗中未考察柱子的粗細(xì)。有研究表明，若柱子過細(xì)，洗脫時易出現(xiàn)樹脂結(jié)塊、壁上氣泡、流速降低等現(xiàn)象[7]。故在后續(xù)試驗中可以增加柱子粗細(xì)的考察，進(jìn)一步優(yōu)化越橘花青素純化工藝。

綜上所述，越橘花青素的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度50%，料液比1:30，提取溫度65 ℃，提取時間60 min ；越橘花青素最佳純化工藝為以D101 樹脂為吸附樹脂，最佳吸附條件為：越橘花青素提取液pH 值為1.5、吸附時間為3 h，采用80%乙醇溶液洗脫，洗脫液pH 值為1.0，洗脫速率為1.0 BV/h。