P2X3受體介導(dǎo)電針調(diào)節(jié)腸易激綜合征內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸5-HT、SERT的作用研究

周云 張方 閆翠娜 李琪 喬宇 黃榕 翁志軍 楊玲 劉慧榮

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病,屬全球流行性疾病,且患病率有逐年上升趨勢(shì)。目前研究認(rèn)為IBS主要與內(nèi)臟高敏感、腦腸軸異常、腸道菌群失衡、生活與飲食習(xí)慣、基因易感性、社會(huì)心理因素等密切相關(guān)[1-2],其中內(nèi)臟高敏感是研究熱點(diǎn)[3]。內(nèi)臟高敏感是指引起內(nèi)臟疼痛或不適刺激的閾值降低,內(nèi)臟組織對(duì)各種機(jī)械、化學(xué)等傷害性刺激反應(yīng)強(qiáng)烈,包括內(nèi)臟痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)異常,擴(kuò)張刺敏感性增強(qiáng)、反應(yīng)性增加的現(xiàn)象,廣泛存在于IBS患者中[4-5]。

本課題組前期研究證實(shí)了針灸對(duì)IBS內(nèi)臟痛存在較好的鎮(zhèn)痛效果,涉及外周、中樞等多個(gè)層面[6-8],且針灸能通過(guò)調(diào)控外周嘌呤能配體門(mén)控離子通路3(purinergicligand-gatedionchannel 3,P2X3)受體的表達(dá)來(lái)降低IBS內(nèi)臟高敏感[6-7];此外,也發(fā)現(xiàn)針灸能通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平發(fā)揮減輕IBS內(nèi)臟高敏感的現(xiàn)象[9]。而有研究發(fā)現(xiàn)5-HT的釋放與P2X3受體相關(guān)[10-12],5-HT再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(serotonnin transporter,SERT)對(duì)控制胃腸道5-HT含量及其受體激活和脫敏又有重要作用,那么P2X3受體和SERT在針灸治療IBS的作用機(jī)制中是否存在關(guān)系,成為一個(gè)新的需要解釋的問(wèn)題。因此,本研究將從電針調(diào)節(jié)IBS內(nèi)臟痛大鼠外周機(jī)制上展開(kāi),探討P2X3受體介導(dǎo)電針對(duì)IBS內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸5-HT、SERT的調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步闡釋針灸對(duì)IBS的作用機(jī)制提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠,體質(zhì)量140～160 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境:12小時(shí)晝夜節(jié)律交替,室溫(20±2)℃,相對(duì)濕度50%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 倫理審查

本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審查(倫理號(hào):PZSHUTCM190315009),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范執(zhí)行。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(P3761,美國(guó)Sigma);P2X3受體激動(dòng)劑(M6517,美國(guó)Sigma);液體石蠟、氯化鈉、氯化鉀、無(wú)水乙醇、二甲苯、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、多聚甲醛、中性樹(shù)膠粘合劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);蘇木精、伊紅(南京建成生物工程研究所);5-HT ELISA檢測(cè)試劑盒(ml003125-C,上海酶聯(lián)生物科技有限公司);serotonin抗體(ab172884,英國(guó)abcam);GAPDH(2118S,美國(guó)CST);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208,碧云天);SYBR Green PCR試劑盒(K0223,美國(guó)Thermo);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(K1622,美國(guó)Fermentas);一次性無(wú)菌針灸針(0.25 mm×13 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);韓式經(jīng)穴刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);電泳儀、轉(zhuǎn)印儀(美國(guó)Bio-RAD);ABI ViiA 7 Real Time PCR System(美國(guó)Applied Biosystems)。

1.4 IBS動(dòng)物模型制備

按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)原則,50只大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和造模組(40只)。正常組大鼠采用0.5 mL生理鹽水灌腸,造模組大鼠采用三硝基苯磺酸(trinitrobrnzen sulfonic acid, TNBS)灌腸法制備IBS內(nèi)臟痛模型,模型制備方法參照Annemie等[13]的操作。實(shí)驗(yàn)大鼠灌腸前禁食不禁水24小時(shí)。灌腸前用2%戊巴比妥鈉按0.25 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠,每只大鼠注入0.5 mL生理鹽水或TNBS灌腸液[TNBS(1 mol/L)∶無(wú)水乙醇∶生理鹽水=51∶150∶299]。灌腸后維持大鼠倒立體位3～5分鐘防止?jié)B出,待大鼠清醒后給予正常飲食飲水,常規(guī)飼養(yǎng)3周后在正常組和造模組大鼠中隨機(jī)各選擇2只進(jìn)行模型鑒定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中造模組有3只大鼠死亡,1只造模不成功,最后每組納入8只。

1.5 動(dòng)物分組與干預(yù)

在確定IBS內(nèi)臟痛模型制備成功后,將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組(MG)、電針組(EA)、P2X3受體激動(dòng)劑組(α,β-meATP)、P2X3受體激動(dòng)劑+電針組(α,β-meATP+EA)。所有大鼠于造模3周后開(kāi)始干預(yù),正常組和模型組采用與電針組相同的抓取、大鼠固定架固定,不做其他處理,連續(xù)7天;電針組:選取雙側(cè)上巨虛、天樞穴[9],直刺,針刺深度均為5 mm,針柄連接韓氏經(jīng)穴刺激儀,疏密波、頻率2/100 Hz、電流1 mA,30分鐘/次,每日1次,連續(xù)7天;P2X3受體激動(dòng)劑組:先麻醉大鼠,然后用微量注射器從大鼠第4、5腰椎棘突間垂直刺入髓鞘內(nèi),大鼠尾部出現(xiàn)甩尾反應(yīng)后,注射P2X3受體激動(dòng)劑α,β-meATP 10 μL[14],濃度10 nmol/μL,連續(xù)7天;P2X3受體激動(dòng)劑+電針組:先在大鼠髓鞘內(nèi)注射P2X3受體激動(dòng)劑α,β-meATP 10 μL,約30分鐘后再進(jìn)行電針干預(yù),電針干預(yù)操作同電針組,連續(xù)7天。

1.6 標(biāo)本采集

標(biāo)本采集前用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,麻醉后將大鼠放置大鼠解剖臺(tái)上,剪開(kāi)腹部皮膚,暴露腹腔,在大鼠肛門(mén)上3 cm處向上取出約4 cm長(zhǎng)的結(jié)腸組織,沿腸系膜處縱行剪開(kāi)腸管,用生理鹽水沖洗結(jié)腸,然后分成4份,1份置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24小時(shí)后脫水包埋切片,用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色;另3份置于-80℃冰箱保存,用于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 腹部撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評(píng)分 于干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行AWR評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照AL-chaer等[15]的操作。評(píng)分前實(shí)驗(yàn)大鼠禁食不禁水24小時(shí),操作前用自制球囊蘸取少量液體石蠟,順大鼠直結(jié)腸生理曲度緩慢從肛門(mén)插入,深度為4～6 cm,將大鼠尾部同球囊一起固定,然后將大鼠放置在評(píng)分盒中,讓大鼠在盒中自由活動(dòng)約30分鐘。待大鼠適應(yīng)環(huán)境后,用三通閥連接球囊和血壓計(jì),分別進(jìn)行20、40、60、80 mmHg四個(gè)不同壓力的結(jié)腸擴(kuò)張(colorectal distention,CRD)刺激。每只大鼠每個(gè)壓力測(cè)量3次AWR評(píng)分,每次持續(xù)約20秒,同一壓力之間間隔1分鐘,不同壓力之間間隔4分鐘,取均值作為最后評(píng)分值。

1.7.2 HE染色 將4 μm的結(jié)腸石蠟切片放進(jìn)60℃烘干箱中烘片60分鐘;二甲苯Ⅰ15分鐘;二甲苯Ⅱ15分鐘;梯度酒精100%→90%→80%→70%,各3分鐘;流水沖洗10分鐘;蘇木精染色2分鐘;流水沖10分鐘;1%鹽酸酒精分化1秒;流水沖洗10分鐘;伊紅染色2分鐘;梯度酒精70%→80%→90%→100%,各1分鐘;二甲苯Ⅰ15分鐘;二甲苯Ⅱ15分鐘;中性樹(shù)膠封片;光學(xué)顯微鏡下觀察,采集圖片。

1.7.3 ELISA檢測(cè) 將0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μL依次加入96孔酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)孔中,用生理鹽水補(bǔ)足到50 μL;除空白孔外,酶標(biāo)板樣本孔中依次加入待測(cè)樣本各10 μL,再加入樣本稀釋液各40 μL;然后依次加入一抗5-HT,空白孔不加;將酶標(biāo)板置于37℃恒溫箱中孵育60分鐘后,將酶標(biāo)板用濾紙吸干;每孔中加入稀釋好的洗滌液,洗滌1分鐘,用濾紙吸干,重復(fù)5次;每個(gè)孔中依次加入試劑盒底物A、B,將酶標(biāo)板置于37℃恒溫箱中避光孵育20分鐘;最后加入終止液50 μL,置于酶標(biāo)儀中測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本濃度。

1.7.4 Western blot檢測(cè) 用RIPA和PMSF裂解結(jié)腸組織,提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,制備10% SDS-PAGE蛋白電泳凝膠,加入蛋白樣品,設(shè)置85V恒壓電泳至分離膠底部;電泳結(jié)束后,將PVDF膜及凝膠固定于轉(zhuǎn)印夾中,125V轉(zhuǎn)膜60分鐘,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,剪下目的條帶,用5%BSA室溫封閉60分鐘;將PVDF膜浸泡于SERT(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)抗體中,4℃搖床孵育過(guò)夜;PBST洗膜4次,每次10分鐘;將PVDF膜浸泡于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1 000)抗體中,室溫?fù)u床孵育1小時(shí);采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集,Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.7.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用Trizol試劑裂解結(jié)腸組織,然后利用氯仿、異丙醇和乙醇提取結(jié)腸組織總RNA,檢測(cè)濃度、純度、完整性。以提取的細(xì)胞總RNA為模板,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增條件為:95℃ 30秒,95℃ 5秒,60℃ 5秒,共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參,以2-△△Ct值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。PCR引物序列由ABI公司的Primer Express Software v 2.0設(shè)計(jì),由華大基因公司合成。SERT上游引物:GTGCTCATCTTCACCGTAATC;SERT下游引物:TTTCTGCCAGTTGGGTTTC;GAPDH上游引物:GGAGTCTACTGGCGTCTTCAC;GAPDH下游引物:ATGAGCCCTTCCACGATGC。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

造模3周后對(duì)正常組和造模組大鼠進(jìn)行結(jié)腸HE染色。結(jié)果顯示:正常組大鼠結(jié)腸各層組織結(jié)構(gòu)完整,腺體形態(tài)正常分布均勻,黏膜層和黏膜下層無(wú)明顯充血、水腫、潰瘍或炎性細(xì)胞浸潤(rùn);造模組大鼠結(jié)腸各層組織結(jié)構(gòu)完整,腺體形態(tài)正常分布均勻,黏膜層和黏膜下層有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和輕微充血水腫。兩組間無(wú)明顯形態(tài)學(xué)差異,符合IBS臨床無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變的結(jié)腸病理表現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

注:A:正常組;B:模型組。

干預(yù)結(jié)束后取各組大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示:正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,腺體排列整齊,黏膜層無(wú)明顯充血水腫或炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,黏膜層和黏膜下層有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層見(jiàn)充血水腫;電針組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,腺體排列整齊,黏膜層和黏膜下層有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和輕度充血水腫;P2X3受體激動(dòng)劑組大鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整,黏膜層和黏膜下層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層見(jiàn)明顯充血水腫;P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,黏膜層和黏膜下層有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層見(jiàn)輕度充血水腫。各組間無(wú)明顯形態(tài)學(xué)差異,見(jiàn)圖2。

注:A:正常組;B:模型組;C:電針組;D:P2X3受體激動(dòng)劑組;E:P2X3受體激動(dòng)劑+電針組。

2.2 行為學(xué)觀察

造模3周后對(duì)各組大鼠進(jìn)行干預(yù)前AWR評(píng)分。結(jié)果顯示,造模組與正常組比較,在各個(gè)壓力強(qiáng)度CRD刺激下的AWR評(píng)分均明顯升高(P<0.05,P<0.01),結(jié)合干預(yù)前結(jié)腸組織HE染色結(jié)果說(shuō)明IBS內(nèi)臟痛大鼠模型制備成功。見(jiàn)表1。

表1 正常組與造模組大鼠造模后AWR評(píng)分比較[M(QU-QL)]

干預(yù)結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行干預(yù)后AWR評(píng)分。結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠在40、60 mmHg壓力CRD刺激下的AWR評(píng)分均明顯升高(P<0.05),在20、80 mmHg壓力CRD刺激下的AWR評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是也呈上升趨勢(shì),從行為學(xué)角度說(shuō)明IBS慢性內(nèi)臟痛敏形成;與模型組比較,電針組大鼠在40、80 mmHg壓力CRD刺激下的AWR評(píng)分均降低(P<0.05,P<0.01),在20、60 mmHg壓力CRD刺激下的AWR評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是也呈下降趨勢(shì),說(shuō)明電針能夠緩解IBS大鼠內(nèi)臟痛。與模型組、P2X3受體激動(dòng)劑組比較,P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠在各個(gè)壓力強(qiáng)度CRD刺激下的AWR評(píng)分均降低;而與電針組比較,P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠在各個(gè)壓力強(qiáng)度CRD刺激下的AWR評(píng)分均升高,說(shuō)明電針可能部分抑制了P2X3受體激動(dòng)劑的作用,從而降低痛閾。見(jiàn)表2。

表2 各組IBS大鼠經(jīng)不同干預(yù)后AWR評(píng)分比較[M(QU-QL),鼠只=8]

2.3 大鼠結(jié)腸5-HT含量檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)大鼠結(jié)腸中5-HT的含量。結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸中5-HT含量升高(P<0.01);與模型組比較,電針組、P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸中5-HT含量均降低(P<0.05);與電針組比較,P2X3受體激動(dòng)劑組大鼠結(jié)腸中5-HT含量升高(P<0.01),P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸中5-HT含量升高。結(jié)果說(shuō)明電針能夠下調(diào)IBS大鼠結(jié)腸中5-HT的含量,且這種調(diào)節(jié)作用可能與電針抑制了P2X3受體相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 各組IBS大鼠結(jié)腸5-HT表達(dá)比較鼠只=8)

2.4 大鼠結(jié)腸SERT表達(dá)檢測(cè)

采用Western Blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸中SERT蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,與正常組比較,造模組大鼠結(jié)腸中SERT蛋白均降低(P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠結(jié)腸中SERT蛋白表達(dá)升高(P<0.01),P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸中SERT蛋白表達(dá)升高;與電針組比較,P2X3受體激動(dòng)劑組大鼠結(jié)腸中SERT蛋白表達(dá)降低(P<0.01),P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸中SERT蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明電針干預(yù)能夠上調(diào)IBS大鼠結(jié)腸中SERT蛋白表達(dá),且這種調(diào)節(jié)作用可能與電針抑制了P2X3受體相關(guān)。見(jiàn)圖3,表4。

表4 各組IBS大鼠結(jié)腸SERT受體蛋白與mRNA表達(dá)量比較鼠只=8)

圖3 各組IBS大鼠結(jié)腸SERT蛋白表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠結(jié)腸中SERT mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:與正常組比較,造模組大鼠結(jié)腸中SERT mRNA表達(dá)均降低(P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠結(jié)腸中SERT mRNA表達(dá)升高(P<0.01),P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸中SERT mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與電針組比較,P2X3受體激動(dòng)劑組大鼠結(jié)腸中SERT mRNA表達(dá)降低(P<0.01),P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸中SERT mRNA表達(dá)降低。結(jié)果與SERT蛋白檢測(cè)結(jié)果一致,說(shuō)明電針干預(yù)能夠上調(diào)IBS大鼠結(jié)腸中SERT的表達(dá),且這種調(diào)節(jié)作用可能與電針抑制了P2X3受體相關(guān)。見(jiàn)表4。

3 討論

中醫(yī)經(jīng)典理論中并沒(méi)有腸易激綜合征這個(gè)病名,根據(jù)IBS的主要臨床表現(xiàn),可將其歸納為“腹痛”“泄瀉”“便秘”等病證范疇。針灸療法作為中醫(yī)學(xué)中的特色療法,具有調(diào)理臟腑、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血、扶正祛邪等功效,針灸療法以中醫(yī)整體觀和辨證論治為指導(dǎo),四診合參,病證結(jié)合,在治療IBS方面經(jīng)驗(yàn)豐富,療效確切[16]。天樞穴、上巨虛穴皆屬于足陽(yáng)明胃經(jīng),二者合用屬于合募配穴,是治療腹痛、腹瀉或便秘的經(jīng)典有效配穴,同時(shí)兩者一升一降,一上一下,相互協(xié)同可達(dá)通暢腸腑氣機(jī)、祛除病邪之功效[17]。

本實(shí)驗(yàn)研究采用TNBS灌腸制備IBS內(nèi)臟痛大鼠模型的方法是比較常用的造模方法[18]。該方法制備的IBS大鼠模型以慢性內(nèi)臟痛表現(xiàn)為主,而結(jié)腸組織沒(méi)有明顯的病理改變,符合IBS的病理學(xué)特征[19]。臨床與動(dòng)物研究[20-21]均證明針灸療法作為一種替代療法在IBS的治療中有較好的療效,尤其是電針療法在鎮(zhèn)痛方面得到了國(guó)際的認(rèn)可[22]。本實(shí)驗(yàn)研究采用合募配穴電針干預(yù)IBS內(nèi)臟痛大鼠,發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)后的IBS內(nèi)臟痛大鼠AWR評(píng)分明顯降低,說(shuō)明電針能夠降低IBS大鼠的內(nèi)臟高敏感,緩解IBS內(nèi)臟痛。

5-HT是一種與胃腸關(guān)系密切的腦腸肽,與IBS內(nèi)臟痛的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。5-HT信號(hào)通路的改變?cè)贗BS的啟動(dòng)和維持環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要作用,可能導(dǎo)致腸道功能異常和敏感性增加[24-25]。SERT是一種負(fù)責(zé)從腸道或組織間隙中再攝取5-HT的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是5-HT信號(hào)通路的必須成員,對(duì)控制腸道內(nèi)5-HT含量及其受體的激活和脫敏具有重要作用[26-27]。SERT表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞內(nèi)5-HT的降解受損,腸道內(nèi)5-HT的濃度增加,致使5-HT受體脫敏,腸道感覺(jué)出現(xiàn)異常[28]。本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)IBS內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸黏膜中SERT蛋白和mRNA表達(dá)明顯減少,而IBS內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸組織中5-HT含量顯著升高,說(shuō)明SERT表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致腸道或組織間隙內(nèi)的5-HT釋放增多,加重IBS大鼠內(nèi)臟痛敏反應(yīng),與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的研究結(jié)果一致[29-30]。而電針干預(yù)能上調(diào)IBS內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸黏膜中SERT蛋白和mRNA表達(dá),降低IBS內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸組織中5-HT含量,說(shuō)明SERT、5-HT參與了電針緩解IBS內(nèi)臟痛的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)P2X3受體和5-HT受體在功能上存在相互作用,在P2X3受體亞基缺乏小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)初級(jí)傳入神經(jīng)元中的5-HT信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生了變化,在P2X3基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)5-HT釋放明顯增多[10],但具體的機(jī)制尚不清楚。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)電針能通過(guò)降低結(jié)腸組織的P2X3受體緩解IBS內(nèi)臟痛[6-7],而腸嗜鉻細(xì)胞中的P2X3受體也能調(diào)節(jié)5-HT信號(hào)的變化[31],那么電針降低結(jié)腸組織的5-HT含量和升高結(jié)腸組織的SERT表達(dá)是否有P2X3受體的參與呢?為了驗(yàn)證這一猜測(cè),本團(tuán)隊(duì)在IBS內(nèi)臟痛大鼠鞘內(nèi)注射P2X3受體激動(dòng)劑α,β-meATP,激活大鼠結(jié)腸初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元上的P2X3受體,觀察IBS內(nèi)臟痛大鼠的行為學(xué)變化和結(jié)腸SERT與5-HT的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠的AWR評(píng)分較P2X3受體激動(dòng)劑組降低,而較電針組升高;P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸5-HT含量較P2X3受體激動(dòng)劑組降低,而較電針組升高;P2X3受體激動(dòng)劑+電針組大鼠結(jié)腸SERT蛋白和mRNA表達(dá)較P2X3受體激動(dòng)劑組升高,而較電針組降低,說(shuō)明P2X3受體參與了電針對(duì)IBS內(nèi)臟痛大鼠結(jié)腸5-HT和SERT的調(diào)節(jié)作用,而電針可能是通過(guò)抑制結(jié)腸P2X3受體減少了腸道內(nèi)5-HT的釋放激活了SERT的表達(dá),有效地改善了IBS大鼠的內(nèi)臟痛癥狀。

以上研究結(jié)果為結(jié)腸P2X3受體參與電針緩解IBS大鼠內(nèi)臟痛的作用機(jī)制提供了更多的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù),但仍存在一些未能解決的問(wèn)題需要進(jìn)一步研究,比如外周和中樞其他部位的P2X3受體是否也參與對(duì)IBS內(nèi)臟痛大鼠5-HT和SERT的調(diào)節(jié)作用,以及SERT與P2X3受體在IBS內(nèi)臟痛的發(fā)生發(fā)展及電針緩解IBS內(nèi)臟痛的過(guò)程中是否存在反饋調(diào)節(jié)作用,還有待于在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。