雞血藤治療糖尿病周圍神經病變的網絡藥理學研究及機制探討

鐵巖 李瀟 楊鑫偉 劉浩龍 許利平

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常見并發癥之一,臨床上主要通過控制血糖、改善神經微循環和營養神經等措施來防治DPN,但是西藥治療效果有限、成本較高且易發生藥物依賴,DPN的治療仍存在局限性[1]。中醫認為DPN屬于肢痹、脈痹、痹證、痿證等范疇,治療在分型論治基礎上多加用化瘀通絡之品[2]。因雞血藤具有良好的活血補血、舒筋活絡功效,常用于治療DPN[3],但其作用于DPN的物質基礎和作用機制研究尚不清楚。

本研究通過網絡藥理學和分子對接技術預測雞血藤治療DPN的活性成分及作用機制,采用UPLC-MS/MS測定雞血藤水煎液化學成分,并通過細胞實驗探究雞血藤藥效物質對DPN中雪旺細胞(schwann cell,SCs)可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 雞血藤活性成分及疾病靶點收集與篩選 通過數據庫與分析平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.wdu.cn/tcmsp.php)中查找雞血藤化合物信息,以口服生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18篩選雞血藤活性化合物。使用TCMSP、Symmap(http://www.symmap.org/)、pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數據庫對化合物進行DPN靶點預測。在GeneCards(http://www.genecards.org/)、 OMIM(http://omim.org/)和DrugBank (https://go.drugbank.com/)數據庫中以“diabetic peripheral neuropathy”為關鍵詞檢索DPN相關靶點。將所有靶點在uniprot(http://www.uniprot.org/)數據庫進行規范。

1.1.2 蛋白質—蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建 將雞血藤活性成分靶點與DPN相關靶點進行韋恩分析,交集靶點即為雞血藤治療DPN的潛在靶點,將其提交至String11.0數據庫,得到PPI網絡并進行可視化,計算各靶點度值。將排名前5的靶點作為雞血藤作用于DPN的關鍵靶點。

1.1.3 通路與功能富集分析 基于Metascape平臺對雞血藤治療DPN的潛在靶點進行GO注釋分析和KEGG通路分析,篩選排名靠前的生物過程和通路并對結果可視化。

1.1.4 雞血藤成分—DPN靶點—通路網絡圖構建 使用Cytoscape3.7.1軟件構建雞血藤成分—DPN靶點—通路網絡圖,利用該軟件內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓樸學參數,包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等,根據Degree選取度值排名前10的化合物作為雞血藤治療DPN的關鍵化合物。

1.1.5 分子對接 在TCMSP、Pubchem數據庫中獲得雞血藤治療DPN的關鍵化合物結構,在Auto Dock Tools中進行去水、加氫操作,保存為pdbqt格式;在PDB數據庫中下載5個關鍵靶點的蛋白質結構,于Pymol軟件中進行去溶劑、去配體,并在Auto Dock Tools中進行加電荷等操作,使用Auto Dock Vina軟件進行分子對接。

1.2 實驗驗證

1.2.1 主要試劑與儀器 雞血藤飲片(購自北京同仁堂藥店,經首都醫科大學副教授羅容鑒定為正品);芒柄花黃素(formononetin,FMNT)(485-72-3,上海源葉生物有限公司);乙腈(AH015,Honeywell);雪旺細胞(Schwann cells,SCs)RSC96細胞系(CRL-2765,ATCC);胎牛血清(C0230,Bovogen);DMEM高糖培養基(C11965500BT,gibco);細胞用雙抗(PB180120,普諾賽);細胞用DMSO(D2650,Sigma)。

CCK8試劑盒(C6005,新賽美);Tunel試劑盒(A112-02,Vazyme);4%多聚甲醛(BL539A,biosharp);白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)抗體(ab9324,abcam);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)抗體(ab205587,abcam);核轉錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)抗體(100745-1-AP,proteintech);磷酸化NF κB抗體(ab76302,abcam);信號傳導轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抗體(10253-2-AP,proteintech);磷酸化STAT3抗體(9145T,CST);β-actin抗體(ab826,abcam);熒光二抗(ab150081,abcam)。

UPLC-MS/MS液質聯用系統(Q Exactive HF,Thermo);冷凍干燥儀(alpha2-4,CHRIST公司);二氧化碳培養箱(310,Thermo公司);酶標儀(Spectramax iD,melecular公司);熒光顯微鏡(TE2000,nikon);化學發光&凝膠成像系統(Fusion Fx6 XT 型,Vilber Lourmat 公司);高內涵篩選分析儀(Cellomics ArrayScan VTI 600,Thermo)。

1.2.2 雞血藤水煎液化學成分鑒定 取適量雞血藤飲片以10倍水浸泡30分鐘后,煎煮兩次,每次1小時,合并水煎液冷凍干燥成粉末。分別精密稱定雞血藤粉末及FMNT對照品配制成溶液,使用UPLC-MS/MS液質聯用系統、Agilent C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)進行雞血藤水提物化學成分分析。

色譜條件:流動相為體積分數0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),洗脫梯度為:0～1分鐘,95%A;1～3分鐘,95%～70%A;3～11分鐘,70%～35%A;11～14分鐘,35%～15%A;進樣量1 μL;流速0.3 mL/分鐘;柱溫25 ℃。

質譜條件:電噴霧電離(electrospray ionization,ESI),正離子模式(噴霧電壓3.8 kV),負離子模式(噴霧電壓-3.1 kV);毛細管溫度320 ℃;鞘氣流速45 arb;輔助氣流速15 L/分鐘;全掃描和二級掃描模式;質譜掃描范圍m/z 200～1200。

1.2.3 雪旺細胞(Schwann cell,SCs)培養及分組 SCs培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養基中,培養條件為37℃、5%CO2。分為以下五組:空白對照組(25 mmol/L葡萄糖DMEM培養基+10%FBS),高糖模型組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養基+10%FBS),FMNT高劑量組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養基+10%FBS+100 nM FMNT),FMNT中劑量組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養基+10%FBS+10 nM FMNT),FMNT低劑量組(150 mmol/L葡萄糖DMEM培養基+10%FBS+1 nM FMNT)。

1.2.4 細胞活力測定 CCK8法檢測細胞活力。將SCs接種于96孔板中按組別對應條件培養48小時后,每孔加入10 μL CCK8溶液孵育并測定450 nm處吸光度。細胞活力=(OD實驗組-OD對照組)/(OD空白組-OD對照組)×100%。

1.2.5 細胞凋亡實驗 TUNEL法檢測細胞凋亡。將SCs接種于24孔板中按條件培養48小時,獲得細胞爬片。用4%多聚甲醛固定,0.1% TritonX-100透化細胞,滴加TUNEL反應液于37 ℃避光孵育2小時。熒光顯微鏡觀察細胞,每組隨機選擇3個視野,記錄凋亡細胞和總細胞數目,計算細胞凋亡率。

1.2.6 高內涵實驗 參考Yang等[4]方法,將SCs接種于96孔板中培養48小時后,棄去培養基,使用4%多聚甲醛進行固定,0.1%TritonX-100透化細胞后使用3%BSA封閉。棄去封閉液,分別加入100 μL的IL-6(1∶100)和TNF-α(1∶100)一抗于4℃條件下孵育過夜。使用對應熒光二抗(1∶200)于室溫下孵育1小時,DAPI對細胞核進行染色。高內涵分析儀獲取目標蛋白熒光圖片及熒光強度。

1.2.7 Western Blot實驗 將各組細胞按條件培養后吸棄培養基,用PBS洗滌后加入RIPA裂解液,獲得細胞蛋白質。使用BCA法對總蛋白質含量進行測定,加入上樣緩沖液煮沸變性,進行SDS-PAGE電泳分離蛋白并電轉移到PVDF膜上,使用5%脫脂奶粉封閉1小時后,加入一抗于4 ℃下孵育過夜。使用的一抗有:NFκB(1∶2000)、p-NFκB(1∶1000)、Bcl2(1∶2000)、STAT 3(1∶2000)、p-STAT 3(1∶2000)、β-actin(1∶2000)。加入對應二抗(1∶20000)室溫孵育1小時,TBST洗膜后加ECL發光液曝光,保存掃描結果。應用Image J軟件獲取條帶灰度值,以β-actin為內參,計算蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 雞血藤活性成分的獲取

基于TCMSP數據庫共篩選出包括兒茶素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、豆甾醇等化合物共24個化合物,見表1。

2.2 雞血藤—DPN交集靶點蛋白互作網絡(PPI network)及關鍵靶點篩選

經數據庫篩選獲得雞血藤活性成分相關靶點150個,DPN相關靶點1533個,二者靶點經Venn分析后得到59個交集靶點(見圖1A)。將59個交集靶點提交至String11.0平臺并用Cytoscape3.7.1對PPI網絡進行可視化,結果顯示網絡涉及52個節點,404條邊。使用內置功能進行網絡分析,設置節點大小反映連接度(degree)大小,即與節點相連的邊越多,連接度值越大,節點也就越大(見圖1B)。選取度值排名前五的靶點,即IL-6、AKT1、STAT3、JUN、MAPK1,認為是雞血藤作用于DPN的關鍵靶點,其主要參數見表2。

注:A:雞血藤—DPN靶點韋恩圖;B:交集靶點PPI網絡圖。

表2 關鍵靶點網絡節點特征參數

2.3 交集靶點GO注釋與KEGG通路富集分析結果

GO注釋分析結果得到生物學過程1686條、分子功能93條、細胞組分81條共1860條信息。結果表明(見圖2A),雞血藤主要參與生物學過程包括對無機物質的反應、細胞對有機氮化合物的反應等,主要發揮的分子功能是細胞因子結合、蛋白激酶活性等,主要影響的細胞組分是膜筏、胞漿外區域等。

注:A:GO富集分析;B:KEGG通路富集分析。

KEGG通路富集分析表明交集靶點顯著富集的通路有糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、胰島素抵抗通路等(見圖2B)。

2.4 雞血藤活性成分—靶點—通路網絡

構建活性成分—靶點—通路圖,通過內置插件分析雞血藤治療DPN網絡拓撲學參數,認為雞血藤發揮作用的關鍵化合物是木犀草素、芒柄花黃素、甘草查兒酮A、維斯體素、 β-谷固醇等,見圖3、表3。

圖3 雞血藤活性成分—靶點—通路—DPN網絡圖

表3 雞血藤治療DPN的關鍵活性化合物網絡節點特征參數

2.5 分子對接驗證

將表2所得關鍵靶點和表3關鍵活性化合物進行分子對接。一般認為結合自由能<-5.0 Kcal/mol二者結合能力較高,結合自由能<-7.0 Kcal/mol二者結合能力高,可見雞血藤關鍵活性化合物與關鍵靶點均有較好的結合(見圖4)。

注:A:關鍵活性成分與關鍵靶點結合自由能;B:FMNT化學結構;C:FMNT與(1)IL-6(2)AKT1(3)MAPK1(4)STAT3結合模擬圖。

2.6 雞血藤水煎液化學成分鑒定

雞血藤水煎液成分正離子圖譜見圖5,經與對照品及文獻[5-6]比對,鑒定了以下9個化合物(見表4)。

圖5 雞血藤水煎液譜圖

表4 雞血藤水煎液UPLC-MS/MS分析

2.7 芒柄花黃素對高糖環境下SCs活性的影響

CCK8結果表明,高糖組細胞活性比空白對照組顯著降低(P<0.01),經不同濃度FMNT治療后,FMNT中低劑量組SCs活性比高糖組有明顯提高(P<0.01)。見表5。

表5 FMNT對SCs細胞活力的影響

2.8 FMNT對高糖環境下SCs凋亡的影響

TUNEL結果表明,高糖處理后SCs中呈綠色的凋亡細胞比例增加,而經過FMNT處理后,凋亡細胞比例降低,表明FMNT可以減少高糖引起的SCs凋亡。發揮抗凋亡作用的Bcl2經高糖處理后表達明顯降低(P<0.01),給與FMNT后可以逆轉了這一現象。進一步證實FMNT可以減少高糖引起的SCs凋亡。見圖6～7,表6～7。

圖6 各組SCs的TUNEL染色

圖7 各組SCs的Bcl2的表達

表6 FMNT對SCs凋亡的影響

表7 FMNT對SCs的Bcl2表達的影響

2.9 FMNT對高糖環境下SCs中IL-6、TNF-α表達的影響

由于SCs并不能像炎癥細胞一樣能夠產生大量的炎性因子,ELISA法難以測出低于常規檢出限的炎性因子,因此采取高內涵法測定IL-6和TNF-α的水平。結果表明,高糖環境下的SCs中IL-6和TNF-α的表達水平升高,說明高糖環境下SCs發生了炎癥反應[與空白對照組比較,差異有統計學意義(P<0.01和P<0.05)],而經過 FMNT的處理后,二者的表達水平顯著降低[與高糖組比較,FMNT中低劑量組作用明顯(P<0.05,P<0.01)],表明 FMNT可以抑制高糖環境下SCs的炎癥反應。見圖8、表8。

表8 FMNT對SCs的IL-6、TNF-α表達的影響

2.10 FMNT對高糖環境下SCs中STAT3-NF κB信號通路的影響

Western Blot法測定經典炎癥通路NF κB及其磷酸化蛋白表達和上游磷酸化STAT3表達水平,驗證FMNT對高糖環境下SCs的的影響。與空白對照組相比,高糖組p-NF κB/NF κB表達顯著增加(P<0.05),p-STAT3表達明顯增加(P<0.05);與高糖組相比,FMNT高、低劑量組p-NF κB/NF κB表達降低(P<0.05),FMNT中低劑量組p-STAT3表達顯著降低(P<0.01)。見圖9～10,表9。

圖9 各組SCs的p-NF κB/NF κB的表達

圖10 各組SCs的p-STAT3的表達

表9 FMNT對SCs中STAT3-NF κB信號通路的影響

3 討論

DPN作為糖尿病常見并發癥,具有高致死率、高致殘率的特點,尋求高效低毒的藥物一直是研究的熱點[1]。雞血藤具有良好的補血活血功效,臨床常用于治療DPN。中藥具有多成分—多靶點—多途徑共同調節的特點,本研究基于網絡藥理學方和分子對接技術篩選雞血藤治療DPN的主要活性成分及潛在靶點,試圖探討其治療DPN的可能機制。

網絡藥理學及分子對接結果表明,雞血藤治療DPN的核心化合物可能是木犀草素、FMNT、甘草查兒酮A、維斯體素、 β-谷固醇。有研究認為,木犀草素具有抗氧化作用,通過降低活性氧和丙二醛水平、增加神經中Nrf2表達,減輕糖尿病大鼠的感覺異常增加神經傳導速度[7];β-谷固醇通過改善胰島素分泌、抑制α-葡萄糖苷酶、降糖和抗氧化作用從而改善DPN大鼠的感覺異常,起到神經保護的作用[8];FMNT可以有效降低DPN大鼠血糖,降低胰島素抵抗,通過增加坐骨神經組織中SIRT1和NGF表達提高神經傳導速度,減少坐骨神經組織的氧化應激[9]。由此可見,雞血藤中不同類型化合物均對DPN有一定的效果,但是雞血藤化學成分復雜,何種物質主要發揮作用并不明晰。因此相較于針對雞血藤化學成分研究,本研究更關注常用的水煎液成分。使用UPLC-MS/MS系統對雞血藤水煎液化學成分進行鑒定,結果表明其主要化合物為黃酮類及其苷類,如FMNT及芒柄花苷。結合網絡藥理學及文獻報道,本研究選擇FMNT作為雞血藤治療DPN的關鍵化合物開展作用機理驗證。

DPN發病機制復雜,涉及多個基因及信號通路,包括神經炎癥、晚期糖基化終末產物堆積等[10],而周圍神經系統中形成神經軸突髓鞘的SCs因其能夠在神經修復和再生中起到關鍵作用,被認為是DPN的主要靶點[11]。網絡藥理學結果表明,雞血藤通過影響糖尿病的晚期糖基化終末產物通路作用于IL-6、STAT3、AKT、MAPK1、JUN等靶點從而起到治療DPN的作用,分子對接實驗證實FMNT與以上靶點均有較好的結合。文獻研究表明,長期高血糖會使葡萄糖與蛋白質氨基反應的產物不斷堆積生成不可逆的糖基化產物,即AGEs,堆積在周圍神經表面,與細胞表面的受體,如RAGEs結合,引起下游一系列有害信號級聯,包括預測靶點中IL-6、STAT3涉及的炎癥相關通路,如NF κB信號通路[12],以及AKT、JUN涉及的凋亡相關通路[13],最終造成SCs凋亡。IL-6是NF κB下游的炎癥指標,其表達水平在DPN患者體內顯著升高[14]。當周圍神經損傷時,損傷部位近端軸突觀察到磷酸化的STAT3,存在STAT3-IL-6信號軸將免疫反應從SCs傳遞到感覺神經元[15];此外,在高糖環境下的SCs中也觀察到磷酸化STAT3表達升高[16]。因此本研究對糖尿病中AGE-RAGEs信號通路的下游炎癥相關通路即STAT3-NF κB通路進行了實驗驗證。

在本研究中,采用DPN細胞模型—高糖環境下SCs,探討雞血藤中主要化合物FMNT的作用。實驗結果表明,高糖環境增加了SCs的炎癥因子IL-6和TNF-α的表達,增加p-NF κB表達量,雖未影響非磷酸化的STAT3表達量,但顯著提高了p-STAT3水平,意味著STAT3-NF κB炎癥通路被激活,導致SCs細胞活力降低,凋亡增加。而經FMNT處理后,逆轉了高糖帶來的不利影響,增加高糖環境下SCs的細胞活力,減少了SCs凋亡,說明FMNT可以保護高糖環境下的SCs,這與抑制STAT3-NF κB通路減少炎癥因子有關。

雞血藤作為臨床常用于治療DPN的藥物,其療效顯著,但其發揮作用的物質基礎及作用機制并不明晰。通過本研究對雞血藤水煎液進行了化學成分鑒定,并運用了網絡藥理學研究方法,建立了“化合物—靶點—通路”網絡,對雞血藤作用于DPN的作用機制進行了探究。但由于網絡藥理學方法從理論層面預測雞血藤的作用機制較為寬泛且針對性不強,本研究只對STAT3-NF κB信號進行了初步驗證,但該通路是否是治療DPN的主要通路?通過通路的阻斷或基因敲高或敲低將能更加明晰其作用機制。其他作用機制是否也參與發揮作用,尚需進一步深入研究。