中醫干預心肌缺血再灌注大鼠療效及PI3K-Akt/Bax/Bcl信號通路影響的Meta分析

葛騰 齊鴻飛 寧博 吳永青 趙明君

心血管疾病發病率已經成為我國患病率之首,據統計2019年患病人數已經達到3.3億[1],其中缺血性心肌病占居民疾病死亡的40%以上,居于首位[2]。目前治療該病最有效的措施是及時恢復血流灌注,但越來越多的證據表明心肌細胞在血液灌注恢復后更容易發生損傷,而且情況更加嚴重甚至出現不可逆的損害,這種現象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI),目前只能抗氧化、減輕鈣超載等治療,仍無特效治療藥物[3]。中醫認為此病屬于“胸痹”“心悸”等范疇,病機主要為本虛標實。因血管長時間閉塞不通而致心失濡養,陽氣虧虛則發心中悸動不安,出現心律失常;雖復流后血流通暢,但正氣虛弱不能推動血流運行,故再發胸痛,正如《金匱要略》所曰:“胸痹而痛,所以然者,則其極虛故也”,甚至氣、血、津、液凝聚不通,出現細胞水腫、凋亡現象。研究表明中醫治療MIRI具有一定的優勢性[4],因此探索中醫藥治療MIRI各方面指標的療效和作用機制尤為重要。近年來越來越多的研究已經證明中醫干預MIRI大鼠模型療效及調控磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt)信號通路有效,但各個研究樣本較少,難以得出明確結論。雖已有Meta分析討論MIRI與PI3K/Akt關系,但干預措施限制為益氣活血養陰類中藥,研究時間已超出5年。故本研究收集國內外基于大鼠實驗對中醫干預MIRI的療效和PI3K/Akt通路表達進行分析與探討,對已有評價進行補充分析,并為中醫治療MIRI和未來研究提供有價值的循證醫學證據。

1 資料和方法

1.1 搜索策略

檢索Cochrane Library、Pubmed、Embase、CNKI、VIP、Wanfang、CBM主流數據庫,檢索從建庫至2022年9月20日。中文以主題結合自由詞檢索,包括:“中醫”“中藥”“心肌缺血再灌注”“大鼠”“PI3K”等詞;英文檢索詞包括:“Traditional Chinese Medicine”“myocardial ischemia reperfusion”“PI3K”“animal”等詞,因預檢索英文數據庫采用主題搜索,文獻較少。故本次英文數據庫檢索采用全文式搜索,降低漏檢率,具體檢索方式見表1。

表1 文獻檢索方式

1.2 納入標準

(1)原始研究為公開發表的研究,包括期刊、學位論文等文獻,有獨立的隨機治療組與對照組;(2)研究對象為不限種類的MIRI大鼠模型;(3)治療組干預措施為不限種類的中醫療法;(4)研究內容清晰、數據完整可提取;(5)MIRI大鼠模型必須符合《醫學實驗動物學》心肌缺血再灌注相關造模標準[5]。

1.3 排除標準

(1)重復發表的研究;(2)無獨立IR對照組的研究;(3)無體內研究,單獨的離體研究;(4)對照組或治療組采用多種干預措施無法對比中醫療效。

1.4 結局指標

常規指標:血清肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α);根據PI3K/Akt信號通路選取心肌組織蛋白磷酸化絲蘇氨酰蛋白激酶B(protein kinase B,Akt) (P-akt)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl相關X蛋白(Bax)的蛋白表達量。

1.5 文獻提取與質量評價

1.5.1 文獻提取 根據上述檢索后導入NoteExpress,兩名研究者獨立篩選、提取數據,若出現分歧由第三方介入解決。納入文獻特征表包括:文獻基礎信息(第一作者、發表年份);研究對象(模型類型、體質量);研究內容(分組方法、干預措施、周期);結局指標。

1.5.2 文獻質量評估 兩位研究者采用動物實驗風險偏倚SYRCLE工具進行評估[6],如出現分歧由第三方介入解決。SYRCLE工具表包括選擇、實施、測量、失訪、報告、其它6種偏倚,每個領域分為“是”“否”“不確定”分別代表“低風險”“高風險”“不確定”。

1.5.3 統計學分析 應用Stata 16軟件進行Meta分析,連續性變量選用標準化均數差(SMD)表示效應值,和95%置信區間(95%,CI)表示。利用連續性變量亞組合并公式合并亞組數據,合并后總樣本N=N1+N2,總均數M=(N1M1+N2M2)/(N1+N2),總標準差SD,公式如下:

用I2來判定異質性大小,若I2<50%或P>0.05提示各項研究不存在異質性,Meta分析采用固定效應模型(fixed effects model,FEM),若I2>50%或P<0.05提示各項研究存在異質性,Meta分析采用隨機效應模型(random effects model,REM),對于異質性來源首先檢查數據是否錯誤,必要時可用敏感性分析或描述性分析。最后對于納入研究文獻≥10篇的結局指標采取敏感性分析討論數據是否可靠,利用剪補法繪制漏斗圖來分析發表偏倚情況。

2 結果

2.1 納入文獻

根據上述的納入與排除標準,對檢索的文獻進行核查篩選。檢索中、英數據庫共得199篇研究,剔除重復研究后對剩余的166篇標題、摘要進行篩選,剔除98篇文獻,68篇文獻進行全文審閱,最終有30篇文獻納入本Meta分析,其中中文28篇、英文2篇,篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程及結果

2.2 納入文獻基本特征

30項研究中28項[7-11,13-17,19-36]中文研究、2項[12,18]英文研究,共涉及684只大鼠,研究地點均在中國。5項研究使用Wistar大鼠[15,18,26-28],25項[7-14,16-17,19-25,29-36]研究使用SD大鼠。除1項研究[14]造建MIRI+OVX模型外其余均為MIRI。根據給藥濃度劃分,5項[15,23,26,30,36]研究有2個亞組,7項[8,11,13,14,28,32,35]研究有3個亞組。中醫干預包括中藥提取物/單體、中藥注射劑、中藥復方、針刺。大鼠體質量大多在200～300 g之間,11項研究[13,18,22-23,25,29-32,34-35]治療療程在造模期間完成,19項研究[7-12,14-17,19-21,24,26-28,33,36]療程天數不等,文獻基本特征見表2。

表2 納入文獻基本特征

2.3 納入文獻風險偏倚評價

根據SYRCLE偏倚風險工具評估納入的30項研究,共10項調查,評估結果為低風險得一分,共10分。本次納入研究的得分為4～6分。6項獲得4分(20%),22項獲得5分(73%),2項獲得6分(7%),具體見表3。

表3 納入文獻偏倚風險評估表

2.4 Meta分析

12項文獻根據給藥濃度進行亞組研究,為更加全面、準確分析中醫干預療效,故合并同一干預措施的不同濃度亞組數據,將合并后的總數據進行Meta分析。

2.4.1 血清cTnI量 8項[7,10,13,22,24-25,29,36]研究報告治療后大鼠血清cTnI改善情況,各研究間存在異質性(I2=80.3%,P<0.001)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯降低大鼠血清cTnI,差異具有統計學意義(SMD=-2.45,95%CI[-3.46,-1.44],P<0.001),見圖2a。其中2項研究[10,24]敏感性分析后發現可信區間與其它研究差距較大,剔除后進行Meta分析示各研究間異質性無統計學意義(I2=52.6%,P>0.05),故采用固定效應模型合并剔除后研究的統計量,結果表明與未剔除之前結果一致,差異具有統計學意義(SMD=-1.5,95%CI[-1.92,-1.08],P<0.001),見圖2b。表明剔除的2項研究為此項結局指標異質性的主要來源。

圖2 中醫干預MIRI模型大鼠血清cTnI的Meta分析

2.4.2 血清CK-MB量 15項[7,10,12,14-15,19-20,22-24,26,28-30,32]研究報告治療后大鼠血清CK-MB改善情況,各研究間存在異質性(I2=86.4%,P<0.001)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照相組比,治療組明顯降低大鼠血清CK-MB,差異具有統計學意義(SMD=-2.47,95%CI[-3.25,-1.68],P<0.001),見圖3a。其中3項研究[10,23,28]敏感性分析后發現可信區間與其它研究差距較大,剔除后進行Meta分析示各研究間異質性無統計學意義(I2=0,P>0.05),故采用固定效應模型合并剔除后研究的統計量,結果表明與未剔除之前結果一致,差異具有統計學意義(SMD=-1.53,95%CI[-1.81,-1.25],P<0.001),見圖3b。表明剔除的3項研究為此項結局指標異質性的主要來源。

圖3 中醫干預MIRI模型大鼠血清CK-MB的Meta分析

2.4.3 血清LDH量 13項[10,12-13,14-15,20-21,26,28-30,32,35]研究報告治療后大鼠血清LDH改善情況,各研究間存在異質性(I2=90.5%,P<0.001)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照相組比,治療組明顯降低大鼠血清LDH,差異具有統計學意義(SMD=-3.24,95%CI[-4.28,-2.21],P<0.001),見圖4a。其中2項研究[10,28]敏感性分析后發現可信區間與其它研究差距較大,剔除后進行Meta分析示各研究間異質性仍存在(I2=80.2%,P<0.05),故采用隨機效應模型合并剔除后研究的統計量,結果表明與未剔除之前結果一致,差異具有統計學意義(SMD=-2.22,95%CI[-2.92,-1.52],P<0.001),見圖4b。表明剔除的2項研究為異質性的部分來源,其還可能與大鼠對藥物敏感度、測量儀器靈敏度、大鼠體質量等有關。

圖4 中醫干預MIRI模型大鼠血清LDH的Meta分析

2.4.4 血清SOD量 6項[13-15,22,32,35]研究報告治療后大鼠血清SOD改善情況,各研究間存在異質性(I2=65.1%,P<0.05)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯改善大鼠血清SOD,差異具有統計學意義(SMD=1.75,95%CI[1.09,2.41],P<0.001),見圖5。

圖5 中醫干預MIRI模型大鼠血清SOD的Meta分析

2.4.5 血清TNF-α量 7項[11,13,15,16,22,27,29]研究報告治療后大鼠血清TNF-α改善情況,各研究間存在異質性(I2=90.3%,P<0.001)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯降低大鼠血清TNF-α,差異具有統計學意義(SMD=-3.55,95%CI[-5.17,-1.93],P<0.001),見圖6。

圖6 中醫干預MIRI模型大鼠血清TNF-α的Meta分析

2.4.6 心肌組織蛋白P-akt表達 10項[9,11,16-18,20,31-33,36]研究報告治療后大鼠心肌組織蛋白P-akt改善情況,各研究間存在異質性(I2=87%,P<0.001)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯上調大鼠心肌組織蛋白P-akt表達,差異具有統計學意義(SMD=5.53,95%CI[3.85,7.21],P<0.001),見圖7。敏感性分析后發現所有研究結果的可信區間差異性小,故異質性主要來源可能與大鼠對藥物敏感度、測量儀器靈敏度、大鼠體質量等有關。

圖7 中醫干預MIRI模型大鼠心肌組織蛋白P-akt的Meta分析

2.4.7 心肌組織蛋白PI3K表達 3項[8,10,34]研究報告治療后大鼠心肌組織蛋白PI3K改善情況,各研究間存在異質性(I2=70.5%,P<0.05)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯上調大鼠心肌組織蛋白PI3K表達,差異具有統計學意義(SMD=11.85,95%CI[7.12,16.57],P<0.001),見圖8。

圖8 中醫干預MIRI模型大鼠心肌組織蛋白PI3K的Meta分析

2.4.8 心肌組織蛋白Bax表達 6項[10-11、14,16,20,36]研究報告治療后大鼠心肌組織蛋白Bax改善情況,各研究間存在異質性(I2=89.2%,P<0.001)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯下調大鼠心肌組織蛋白Bax表達,差異具有統計學意義(SMD=-5.3,95%CI[-7.62,-2.98],P<0.001),見圖9。

圖9 中醫干預MIRI模型大鼠心肌組織蛋白Bax的Meta分析

2.4.9 心肌組織蛋白Bcl-2表達 7項[10-11,14,16,20,23,36]研究報告治療后大鼠心肌組織蛋白Bcl-2改善情況,各研究間存在異質性(I2=94.3%,P<0.01)采用隨機效應模型合并統計量,結果顯示與對照組相比,治療組明顯上調大鼠心肌組織蛋白Bcl-2表達,差異具有統計學意義(SMD=3.7,95%CI[1.3,6.09],P<0.001),見圖10。

圖10 中醫干預MIRI模型大鼠心肌組織蛋白Bcl-2的Meta分析

2.5 敏感性分析

對納入10篇及以上文獻的3項結局指標血清CK-MB、LDH、心肌組織蛋白P-akt進行敏感分析,逐一剔除每項研究后查看結局是否發生變化,詳見圖11。血清CK-MB指標中有3項研究與其它差異較大,LDH指標中有2項研究與其它差異較大,而心肌組織蛋白P-akt指標結果較為集中。敏感性分析結果表明以上3項結局指標均不會因為剔除某項研究而發生結局指標的變化,表明Meta分析結論可靠。

注: a為CK-MB敏感性分析;b為LDH敏感性分析;c為P-akt敏感性分析。

2.6 發表偏倚分析

對納入10篇及以上文獻的3項結局指標血清CK-MB、LDH、心肌組織蛋白P-akt進行發表偏倚分析,采用Egger’s test,若P<0.05提示存在發表偏倚,進一步利用剪補法添加虛擬數據后分析是否會逆轉此項結局指標。

2.6.1 血清CK-MB偏倚分析 對納入15篇文獻的血清CK-MB結局指標進行偏倚分析后表明偏倚存在(Egger’s test t=-5.76,P<0.05),進一步使用剪補法分析,添加2篇虛擬數據后隨機效應結果(SMD=-2.85,95%CI[-3.71,-2.00])與未添加前血清CK-MB的隨機效應結局無逆轉(SMD=-2.47,95%CI[-3.25,-1.68]),故此項指標雖存在發表偏倚但結局依然穩健。見圖12。

圖12 中醫干預MIRI模型大鼠血清CK-MB的剪補漏斗圖

2.6.2 血清LDH偏倚分析 對納入13篇文獻的血清LDH結局指標進行偏倚分析后表明偏倚存在(Egger’s test t=-7.14,P<0.05),進一步使用剪補法分析,添加1篇虛擬數據后隨機效應結果(SMD=-3.69,95%CI[-4.93,-2.4])與未添加前血清LDH的隨機效應結局無逆轉(SMD=-3.24,95%CI[-4.28,-2.21],故此項指標雖存在發表偏倚但結局依然穩健。見圖13。

圖13 中醫干預MIRI模型大鼠血清LDH的剪補漏斗圖

2.6.3 心肌組織蛋白P-akt偏倚分析 對納入10篇文獻的心肌組織蛋白P-akt結局指標進行偏倚分析后表明偏倚存在(Egger’s test t=6,P=<0.05),進一步使用剪補法分析,但未添加虛擬數據,隨機效應結果(SMD=5.53,95%CI[3.85,7.21]),故此項指標雖存在發表偏倚但結局依然穩健。見圖14。

圖14 中醫干預MIRI模型大鼠心肌組織蛋白P-akt的剪補漏斗圖

3 討論

3.1 分析總結

本項研究表明中醫藥療法能顯著降低MIRI大鼠模型的cTnI、CK-MB、LDH、TNF-α血清含量與Bax心肌組織蛋白表達,并提升SOD血清含量與P-akt、PI3K、Bcl-2心肌組織蛋白表達。其中cTnI已被廣泛應用于心肌梗死診斷中,是心肌受損過程中的高特異性指標,在心肌受損早期cTnI可快速入血,血清中cTnI急速上升[37],故稱其為梗死金指標;血清CK-MB在正常人體中水平較低,發生心肌受損時CK-MB從心肌進入血清中顯著升高[38],故作為急性心梗的重要診斷與預后指標;LDH是存在于心肌組織中的一種代謝酶,心肌細胞損傷時血清LDH升高,而LDH升高會進一步加劇心肌細胞損害從而陷入惡性循環[39];TNF-α是一種可誘導心肌細胞凋亡的炎癥因子,參與心室重構,在心肌梗死后水平顯著增加[40];SOD是一種自由基清除劑,在發生MIRI時,SOD可清除大量氧自由基,保護心肌細胞免受自由基的損傷,維持機體內的抗氧化平衡[41-42];而Bax與Bcl-2蛋白是一對相互拮抗的凋亡與抗凋亡蛋白,屬PI3K/Akt通路下游靶蛋白[43]。正常人體心肌細胞處于凋亡與抗凋亡的動態平衡中,主要依靠Bax/Bcl-2蛋白比值決定。其中Bax屬于促凋亡蛋白,Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,二者相互拮抗,通過形成二聚體調控細胞凋亡。Bax/Bcl-2比值高時,同源二聚體形成較多,可促進細胞凋亡,Bax/Bcl-2比值低時,異源二聚體形成較多,可抑制細胞凋亡[44]。在MIRI刺激下,Bad蛋白與分子伴侶蛋白裂解,使Bax表達上調,激活細胞凋亡程序。而Akt活化后將Bad蛋白的Ser136磷酸化與Bax競爭結合分子伴侶蛋白14-3-3,從而使Bax蛋白失去誘導凋亡能力[45],見圖15。

圖15 PI3K-Akt/Bax/Bcl 調控細胞凋亡信號通路圖

因此,本文對30項中外研究中醫干預MIRI大鼠模型的cTnI、CK-MB、LDH、TNF-α、SOD血清含量進行分析,目的為評價中醫治療的有效性,對P-akt、PI3K、Bax、Bcl-2心肌組織蛋白表達進行分析,目的為評價中醫治療MIRI的機制。基于此,本研究對中醫相關療法通過PI3K-Akt/Bax/Bcl信號通路以改善患者心肌缺血再灌注后心肌細胞損傷為目的,從心肌細胞損傷的生化指標與通路蛋白的表達2個方面進行Meta分析,不僅論證了中醫治療MIRI的有效性,而且為中醫相關機制研究增加了循證學依據,見圖16。

圖16 本文分析流程圖

3.2 研究局限性及異質性來源

本項研究納入總文獻30篇,英文文獻占2篇,未納入其他語言文獻,且研究地點均在中國,實驗模型均為大鼠,納入文獻質量評分較低,總體樣本數量較少,異質性較大,Egger運算仍有偏倚存在。對于異質性來源本文僅探討納入≥8篇文獻的結局指標4項,其中2項研究異質性來源為文獻間差距較大,去除相關文獻后無異質性。另外2項研究主要異質性來源不知,可能與以下幾點有關:(1)中醫干預措施不同,治療效果不同;(2)所納入研究大鼠樣本量不一,存在大量小樣本研究;(3)大鼠對藥物敏感性不同;(4)測量儀器精準度不同。

此次研究總結補充中醫不同療法治療MIRI在不同指標方面的療效,其機制可能與PI3K-Akt/Bax/Bcl信號通路有關。但結論的準確性仍需更高質量、更大樣本的動物實驗來給予驗證。