以線粒體自噬為靶點的益氣活血類中藥保護心肌缺血再灌注損傷研究進展

蔡丹陽 李潔 李運倫

來自全球疾病負擔的數據顯示,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是致殘率、致死率較高的疾病之一[1]。冠狀動脈疾病會導致冠狀動脈血流受限或缺血癥狀,是CVD最常見的形式。由于及時的再灌注醫療策略,如經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)和冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting,CABG),可同時促進心肌梗死邊緣區血流量的恢復和挽救瀕死的心肌細胞,在過去幾十年中CVD死亡率有所降低。但在此過程中往往會引起心肌的二次損傷,即心肌缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注損傷有多種機制,包括線粒體自噬、線粒體Ca2+超載、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成、血小板活化、微血栓形成等,其中線粒體自噬是新近研究熱點。研究證實益氣活血類中藥能增強或減弱線粒體自噬從而防治缺血性心臟病。本文就近年來采用益氣活血法調控線粒體自噬防治缺血性心臟病的相關研究進行歸納總結,以期為益氣活血法防治心肌缺血再灌注損傷的臨床應用提供新的依據。

1 線粒體自噬途徑及其在心肌缺血再灌注損傷中的作用

Lemasters[2]于2005年首次提出“線粒體自噬”概念。研究表明,線粒體功能障礙是導致缺血性心臟病發生的主要原因。線粒體自噬可以清除功能異常的線粒體和用新的線粒體代替之間取得良好的平衡,最大程度保護心肌細胞。線粒體自噬缺陷可導致動物心臟退行性疾病并改變線粒體自噬通量,這也被證明會影響一些心血管疾病的預后,如心肌梗死、各種類型的心肌病和動脈粥樣硬化等。在哺乳動物細胞中,有多條信號通路被證實參與介導線粒體自噬的過程,目前介導線粒體自噬的調節機制主要包括誘導同源性磷酸酶張力蛋白誘導的激酶1(PINK1-Parkin)、BCL2 相互作用蛋白3(BCL2 interacting protein 3,BNIP3)/NIP3樣蛋白X(NIP3-like protein X,NIX)(BNIP3/NIX),以及FUNDC1 (FUN 14 domain containing protain 1)等[3-5],見圖1。

圖1 線粒體自噬途徑及其在心肌缺血再灌注損傷中的作用

1.1 PINK1-Parkin途徑

PINK1-Parkin途徑是線粒體自噬最經典的方式之一。在健康的線粒體中,PINK1位于線粒體外膜,可利用氨基末端的線粒體靶向序列,在轉位酶的帶動下到達內膜進行降解。整個過程中,PINK1可以持續不斷地監測線粒體不同時期的健康狀態,并在線粒體功能受到阻礙時,快速發出信號[6]。當線粒體受損,線粒體通透性轉換孔(mitochondral permeablity transition pore,mPTP)的去極化,導致PINK1在線粒體外膜處積聚,將部分泛素磷酸化,并促進Parkin向線粒體外膜募集和激活。激活后的Parkin可以泛素化電壓依賴性陰離子通道(voltagedependent anion-selective channel 1,VDAC1)、線粒體融合蛋白(mito-fasion 1,MFN1)/MFN2等,泛素化的MFN2通過蛋白酶體降解,導致線粒體分裂,同時泛素化的VDAC1會募集自噬受體OPTN,進而誘導線粒體自噬[7-8]。而當PINK1-Parkin和其他線粒體自噬相關基因發生突變時,就會導致線粒體自噬功能障礙,進一步導致受損線粒體的積累、氧化應激以及神經元死亡[9-10]。

當心肌缺血再灌注發生時,線粒體膜電位上升導致線粒體Parkin蛋白加速轉運,線粒體自噬被激活。Siddall等[11]采用缺血再灌注模型,發現敲除Pink1基因的小鼠,心肌細胞線粒體形態雜亂無章,梗死面積顯著增加,同時ROS誘導的線粒體膜電位去極化也更敏感。另一項關于Parkin1基因敲除研究中發現,實驗組相較于對照組線粒體紊亂更為顯著,在缺血再灌注中心肌損傷面積更大、小鼠生存率更低[12]。因此,PINK1-Parkin介導的線粒體自噬,通過清除受損線粒體在心肌中的累積,減少心臟梗死面積,治療缺血性心臟病。

1.2 BNIP3/NIX途徑

BNIP3和NIX是一種同源蛋白,均定位于線粒體,具有相同LIR基序,可與LIR結合作為自噬受體,直接與自噬體上的LC3結合,其中BNIP3與LC3的結合需要其同二聚體化,進而誘導線粒體自噬的發生。但是,在線粒體自噬過程中BNIP3和NIX的表現略有不同,BNIP3在缺氧期間調節線粒體自噬,BNIP3的功能涉及相反的兩方面:一方面是誘導細胞凋亡或壞死,起到促進死亡的作用;另一方面,引起自噬或線粒體自噬,起到促存活作用,而NIX調節紅細胞譜系成熟時線粒體的自噬過程[13-17]。當細胞處于惡劣的環境下,BNIP3可誘導過度線粒體自噬,導致細胞死亡,而NIX并不能誘導過度的線粒體自噬[18-19]。

BNIP3/NIX介導的線粒體自噬主要作用于缺血性心臟病早期。缺血再灌注時,心肌細胞處于嚴重缺血、缺氧的狀態,活性氧類物質(reactive oxygen species,ROS)的大量生成,ROS生成后,快速激活BNIP3介導的線粒體自噬并清除功能異常的線粒體,同時利用此過程分解得到的氨基酸和脂肪酸,來幫助細胞渡過缺血缺氧導致的能量耗竭,恢復細胞穩態[20-21]。有學者發現,在SD大鼠缺血再灌注早期,BNIP3表達量會隨著缺血再灌注時間點的升高而升高,缺血缺氧的狀態也隨之不斷變少[22]。因此,通過BNIP3介導的線粒體自噬可有效清除損傷的線粒體,對ROS的大量釋放及細胞死亡通路的激活有重要作用。

1.3 FUNDC1途徑

FUNDC1是由中國科學院動物研究所陳佺研究員課題組發現的,通過啟用線粒體自身的蛋白酶系統或線粒體自噬機制幫助細胞維持蛋白質穩態[23-24]。健康狀態下,FUNDC1被第13位絲氨酸的激酶(casein kinase 2,CK2)和第18位酪氨酸的激酶(src family kinase,Src)磷酸化,處于磷酸化狀態下的FUNDC1與LC3相互作用不明顯。而在心肌缺血缺氧狀態下,PGAM5脫磷磷酸化FUNDC1,去磷酸化的 FUNDC1和LC3相互作用增強,從而第一時間激發線粒體自噬[25-27]。

迄今為止,大多數研究證實FUNDC1介導的線粒體自噬在心肌缺血再灌注損傷中具有保護作用。研究發現 Mst1在缺血再灌注后顯著上調,并且Mst1通過抑制RK-CREB信號通路和抑制FUNDC1介導的線粒體自噬,防止心肌缺血再灌注發生[28]。另有研究發現,缺血再灌注后,Ripk3明顯上調,從而抑制FUNDC1介導的線粒體自噬,因此,FUNDC1通路的調控,可能是心臟再灌注損傷中心臟保護的一種新策略[29]。以上結果提示,適當促進再灌注時期,心臟微血管內皮細胞中FUNDC1介導的線粒體自噬,有利于心肌保護。

2 益氣活血類中藥干預線粒體自噬治療心肌缺血再灌注

研究表明,中藥單體、組分、復方都可以通過調節不同通路或受體蛋白介導線粒體自噬,保護缺血再灌注損傷。通過研究益氣活血類中藥的有效成分、藥理作用及分子機制,最大限度發揮靶向調節作用,是研究缺血性心臟病的重要研究方向之一。

2.1 干預PINK1-Parkin信號通路介導的線粒體自噬

黃芪甲苷是黃芪皂苷中主要活性成分之一。在缺血性心臟病中可防止心肌纖維化,提高心肌收縮能力,保護心肌細胞免受缺血、缺氧的損傷[30-31]。李旭陽等[32]通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型,結果表明,黃芪甲苷通過作用于PINK1-Parkin途徑,可明顯降低心肌損傷標志物肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase,AST),抑制心肌細胞凋亡,改善線粒體自噬,治療缺血性心臟病。張東偉等[33]實驗同樣在大鼠缺血再灌注模型中檢測生化指標CK-MB、總膽固醇(cholesterol,CHOL),結果表明黃芪甲苷對缺血再灌注損傷的心肌的保護作用可能與降低炎癥反應、抑制PINK1-Parkin 通路介導的線粒體過度自噬相關。除此之外,黃芪甲苷還可基于PINK1-Parkin通路,減少自噬體聚集,改善線粒體功能,抑制自噬蛋白如LC3II及P62的表達,保護心肌細胞,防止缺血再灌注損傷。

三七總皂苷是中藥三七中極重要的活性成分之一。在心肌缺血缺氧狀態下,三七總皂苷可顯著增強ATP酶活性成分,加速線粒體生成與轉化,減少因線粒體受損引起的的缺血、缺氧、細胞損傷,調節線粒自噬。楊子平等[34-35]實驗表明,三七總皂苷能降低再灌注損傷中血清心肌損傷標志物LDH和CK的含量,防止活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量產生與累積,通過抑制線粒體自噬PINK1-Parkin通路,影響線粒體自噬結合和裂解,進而保護心臟。三七總皂苷防止缺血再灌注損傷文獻中少有涉及,目前研究表明,三七總皂苷主要通過自噬通路PINK1-Parkin,抑制心肌纖維化,緩解氧化應激,治療缺血性心臟病。

加味丹參飲在缺血性心臟病中,具有減少炎癥因子,降低心肌線粒體腫脹,改善線粒體功能,調節自噬等作用[36-37]。楊艷紅等[38]發現,加味丹參飲可明顯升高模型組Parkin蛋白的表達,使冠狀動脈內皮細胞超微結構有所改變。因此,加味丹參飲在線粒體自噬過程中,嚴格把控線粒體質量和數量,并通過PINK1-Parkin通路激活線粒體自噬,減輕缺血再灌注損傷。在治療缺血性心臟病中,不僅遵守了益氣活血的治療準則,其有效成分在后期的調養中也發揮著必不可少的作用。

益脈顆粒具有補氣、活血、滋陰等功效。由于其重要的抗心律失常、抗血栓,減輕心肌炎癥、抑制細胞凋亡、改善心肌缺血缺氧等功能,被廣泛應用于缺血性心臟病的治療當中[39-40]。張東偉[41]的研究發現,益脈顆粒給藥后,線粒體自噬相關蛋白PINK1、Parkin、P62表達量明顯降低,并通過PINK1-Parkin的調節,促進線粒體融合、分裂,維持線粒體動態平衡,進而減輕大鼠缺血再灌注心肌損傷。綜上,經益脈顆粒干預后,大鼠心肌纖維排列整齊,其有效成分可改善心肌組織間的水腫,減少炎性細胞。因此,益脈顆粒可通過PINK1-Parkin通路保護心肌,治療缺血性心臟病。

益氣活血方是在補陽還五湯的基礎上研制而成,由益氣藥和活血藥組成。羅晨曦[42]研究發現,LC3I、LC3II、PINK1、Parkin、P62分別作為自噬標志物,在缺血再灌注損傷中,益氣活血方可明顯增加PINK1、Parkin、P62蛋白與抑制LC3II/LC3I自噬蛋白的表達,因此推測益氣活血方通過PINK1-Parkin途徑,抑制線粒體過度自噬,維持線粒體質量與數量,保護線粒體結構功能,改善線粒體腫脹與結構的破裂,進而治療缺血性心臟病。

通心絡膠囊在缺血性心臟病中發揮著不可替代的作用,它可以通過上調AMPK蛋白表達,抑制缺血缺氧誘導的心肌細胞凋亡[43]。YANG等[44]采用大鼠缺血再灌注損傷模型,經檢測自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、p62、Beclin1表達水平發現,通心絡可以通過PINK1-Parkin線粒體自噬通路,與泛素蛋白酶一同清除損傷的線粒體,維持胞內平衡,進而治療缺血性心臟病。除此之外,通心絡膠囊可以增加血管彈性,降低炎癥因子的釋放,有利于治療缺血性心臟病。

2.2 干預BNIP3/NIX信號通路介導的線粒體自噬

三七總皂苷作為常用的治療心血管疾病的天然產物成分[45],研究發現,通過結扎冠狀動脈左前降支,構建SD大鼠缺血再灌注模型, 給藥三七總皂苷預處理7天,心肌組織中大量的HIF-1α、BNIP3 和 Beclin1被激活,血清中CK-MB、LDH等炎癥標志物降低,自噬蛋白LC3II/LC3I表達升高,心肌組織線粒體損傷減弱。因此,三七總皂苷可以通過激活BNIP3/NIX途徑,降低炎癥因子表達,增強線粒體自噬, 有效防止缺血再灌注損傷。

丹酚酸B是一種酚類化合物,對缺血性心肌具有保護作用[46]。實驗結果表明,通過缺氧4小時復氧2小時,構建H9c2心肌細胞模型,通過給藥丹酚酸B,可降低LC3-II/LC3-I比值及促凋亡蛋白(NIP3-like protein X,NIX)表達水平,并升高線粒體膜電位[47]。辛高杰等[48]的一項研究同樣表明,丹酚酸B能夠保護H9c2心肌細胞中缺血再灌注損傷, 增加線粒體膜電位,削弱caspase-3和LC3II的蛋白表達,同時增加細胞活性。因此,丹酚酸B通過促凋亡,減少心肌缺血、缺氧,對心肌細胞的保護作用機制均與NIX介導的線粒體自噬密切相關。

2.3 干預FUNDC1介導的線粒體自噬

雙參寧心膠囊主要包括人參總皂苷、延胡索生物堿和丹參總酚酸。雙參寧心膠囊可以益氣、化瘀、改善心臟凝血功能,減輕缺血缺氧狀態下的心肌損傷,維持穩定的線粒體功能,保護心臟[49]。辛高杰等[50-51]采用大鼠缺血再灌注損傷模型,通過檢測血清中損傷標志物CK、LDH、CK-MB明顯升高,Western blot 實驗中FUNDC1蛋白表達增高,表明缺血再灌注損傷時FUNDC1介導的線粒體自噬被激活。因此,雙參寧心膠囊可通過FUNDC1通路抑制線粒體自噬,防止缺血性心臟病的發生。具體詳見表1。

表1 益氣活血類中藥單體及復方調控線粒體自噬治療缺血性心臟病

本實驗室也針對FUNDC1信號通路做了相關研究,通過構建心肌缺血再灌注損傷小鼠模型,從調節內皮細胞線粒體自噬的角度,研究人參皂苷RG1與三七皂苷R1組分對模型小鼠的抗心肌再灌注損傷作用機制。結果發現,RG1-R1組分藥改善了心肌缺血再灌注損傷小鼠的心功能,逆轉了心肌缺血再灌注損傷小鼠心臟的心肌病理變化;其次,電鏡結果發現RG1-R1組分藥能促進 FUNDC1介導的線粒體自噬,干預心肌缺血再灌注損傷,且其調控 FUNDC1 介導的線粒體自噬的機體機制可能與CK2α通路密切相關。

3 小結

線粒體是心肌細胞能量的主要源泉,參與調控細胞凋亡與信號轉導等關鍵環節。當細胞處于缺血、缺氧環境中,受損線粒體會發生選擇性、有序性自噬降解,以維持心肌細胞內環境穩態和某些細胞器的更新。線粒體自噬作為機體的一種選擇性降解機制,在心肌細胞中發揮了雙刃劍作用。過度激活線粒體自噬會導致線粒體大量丟失,線粒體自噬不足會導致線粒體堆積,引發心肌的功能障礙。只有適當調控線粒體自噬機制,及時清除受損線粒體,維持線粒體質量與體內能量供應,防止損傷后的炎癥反應和纖維化等,才能改善心功能,減輕心肌缺血再灌注損傷。線粒體自噬防治缺血再灌注損傷主要通過PINK1-Parkin、FUNDC1、BNIP3L/NIX等信號通路啟動,不同途徑間存在相互聯系和影響。

中醫藥治療缺血性心臟病具有全面性、靈活性、 毒副作用小、 藥源豐富等特色和優勢。綜上,益氣活血類中藥單體(丹參酮IIA、三七皂苷、人參皂苷、丹酚酸B、黃芪甲苷等)及中藥復方(益氣活血方、雙參寧心膠囊等)可通過調節線粒體自噬途徑,發揮防止線粒體腫脹與結構的破裂,降低炎癥因子,抑制心肌細胞凋亡等作用,進而治療缺血性心臟病(見表1)。除此之外,益氣活血類中藥可能具有其他有益作用,包括調控代謝、抗炎和抗氧化等。

如何使線粒體自噬最大程度的發揮保護心肌缺血、缺氧的作用,還需進一步研究探索。目前益氣活血類中藥改善缺血再灌注損傷仍處于初級階段,動物模型參差不齊,統一標準不夠完善,臨床實驗證據不足,除經典通路和蛋白外其他機制涉及不多等諸多問題。雖然益氣活血類中藥單體及復方在一定程度被證明有效,但仍沒有發揮出最大潛力。益氣活血類中藥是否比已知的自噬調節劑如HDAC抑制劑、二甲雙胍、環孢素和mTOR抑制劑更具優勢尚不清楚,但這篇綜述有助于闡明新型自噬調節劑的設計,從而為未來治療缺血性心臟病的線粒體自噬精細控制指明方向。