α-半乳糖基神經酰胺靜脈注射對小鼠肝臟恒定性自然殺傷T細胞及亞群的影響

陳俊玉，張景楠，彭楠，滕景芳，曹彩霞，孟明，王彥

作者單位：1河北大學附屬醫院檢驗科，河北 保定071000；2河北大學基礎醫學院，河北 保定071000；3保定市中心血站，河北 保定071000

自然殺傷T細胞（natural killer T cell，NKT cell）是一類兼具T細胞相關受體和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK cell）相關受體的淋巴細胞亞群。根據細胞是否表達恒定TCR鏈，NKT細胞可分為恒定性NKT（invariant NKT，iNKT）細胞與多樣性NKT（diverse NKT，dNKT）細胞。通過CD1d分子提呈的糖脂類抗原可與iNKT細胞的TCR結合使其活化，活化的iNKT細胞可迅速高效地分泌大量細胞因子和趨化因子［1］，通過與其他免疫細胞的相互作用，調控機體的免疫系統，在造血、腫瘤、自身免疫病等方面發揮重要的作用［2-4］。根據其分泌細胞因子的不同，iNKT細胞可分為iNKT1、iNKT2、iNKT10及iNKT17亞群［5］，分別分泌干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-4、IL-10、白細胞介素-17（IL-17）。不同的iNKT細胞亞群功能不同，甚至截然相反，故iNKT細胞不同方向的激活以及亞群的差異分布，可調控免疫反應朝不同的方向進展，并且產生不同強度的免疫反應，對機體起到雙向調節作用［6］。

α-半乳糖基神經酰胺（α-GalCer）是一種從海綿中提取的糖脂類物質，可特異性激活iNKT細胞，刺激其增殖活化并釋放多種促炎和抑炎因子［7］，在不同器官中引起不同亞群的變化。研究表明，肝組織中存在大量的 iNKT 細胞，約為其他器官的20～100倍，約占肝臟總淋巴細胞數的20%～35%［8］，是體內重要的免疫反應器官。大量研究表明，iNKT細胞與許多肝臟疾病如乙型病毒性肝炎、肝癌、自身免疫性肝病等有著密切的關系［9-11］。由于iNKT細胞對機體的調控具有雙向功能，因此研究如何使iNKT細胞向保護機體的方向分化至關重要。本研究自2022年1―3月通過采用靜脈注射α-GalCer的方式，用流式細胞儀在注射完成后第2、4、6、8、10天對小鼠肝臟中的 iNKT 細胞頻率和亞群進行檢測，外周血血清中 IL-4，IFN-γ，IL-17A 的表達水平采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測，來探討靜脈注射α-GalCer對肝臟中iNKT細胞增殖與分化的影響，從而為臨床上肝臟相關疾病中以iNKT為靶標的免疫治療提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 C57BL/6J雄性4～5 周齡小鼠。購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號SCXK（京）2019-0008。飼養于 無特定病原體（SPF）級動物室內，所有動物均適應飼養1周后予以分組進行實驗。大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2 實驗材料與儀器

1.2.1 材料 α-GalCer購于AdipoGen 公司，小鼠組織淋巴細胞分離液、0.5 mol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）、牛血清白蛋白（BSA）購于北京索萊寶生物科技有限公司，Foxp3/TRN Factor Stain Buffer購于Invitrogen 公司，FITC Hamster Anti-Mouse TCR-β、AlexaFluor?647-mouse anti-PLZF、BV421 Mouse Anti-Mouse RORγt購于美國BD Pharmingen公司，T-selected-CD1d tetramer-PE 購于日本MBL公司，PE/Cyanine7 anti-T-bet Antibody購于美國Biolegend公司。小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17A ELISA試劑盒購于杭州聯科生物技術股份有限公司。

α-GalCer 溶液的配制： 以100%的二甲基亞砜溶液（DMSO）溶解α-GalCer成濃度為1 g/L，用 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）稀釋到10 mg/L，現配現用。

1.2.2 儀器 流式細胞儀FACS CantoII 為美國BD Pharmingen公司產品，酶標儀為美國Bio-tek EPOCH公司產品。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 選擇C57BL/6健康雄性小鼠60只，采用隨機數字表法分為觀察組和對照組，每組30只（每組分為5個時間點，每個時間點6只小鼠）。觀察組以100 ng/g體質量的劑量注射α-GalCer，對照組以同樣的注射方式注射相同劑量的生理鹽水。

1.3.2 小鼠肝臟中淋巴細胞的獲取 分別于注射后第2、4、6、8、10天取小鼠肝臟組織，在培養皿中加入適量的 PBS，潤濕細胞篩，剪碎組織并研磨，制備單細胞懸液，1 000 r/min，4 ℃離心8 min，獲取細胞沉淀，PBS重懸后轉移到裝有淋巴細胞分離液的離心管中，2 000 r/min，4 ℃，20 min進行密度梯度離心，分離出淋巴細胞。PBS 清洗離心，棄上清后獲取單細胞懸液。

1.3.3 流式細胞術（FACS）檢測肝臟中iNKT細胞頻率 計數單細胞懸液并調整細胞密度，置于流式管中（每管1×106個細胞），加入anti-TCRβ 1 μL和α-GalCer負載的CD1d-tetramers 1 μL并混勻，4 ℃避光孵育30 min，1 mL PBS清洗重懸，1 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，加500 μL PBS重懸，FACS檢測。

1.3.4 FACS 檢測肝臟中 iNKT 細胞亞群 同“1.3.3”，清洗棄上清后，依據 Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer試劑盒的具體操作步驟對細胞進行透化固定處理，4 ℃避光45 min，加1 mL破膜緩沖液，4 ℃ 500g離心 5 min，棄上清，加入1 μL PLZF，1 μL T-bet和1 μL ROR-γt ，混勻，4 ℃避光孵育 30 min，加1 mL破膜緩沖液渦旋混勻，4 ℃條件下500g離心 5 min，棄上清，加 500 μL PBS 重懸，FACS上機檢測。

1.3.5 ELISA檢測外周血血清IL-4，IFN-γ，IL-17A水平 小鼠眼球血，4 ℃條件下，12 000 r/min離心8 min，離心后血清轉移到EP 管中，-20 ℃保存，檢測前低溫復溶。采用杭州聯科生物技術股份有限公司提供的Mouse IL-4、IFN-γ，IL-17A ELISA試劑盒進行檢測，嚴格按照產品說明書進行操作。

1.4 統計學方法 所有數據用 SPSS 24.0 軟件進行統計分析，計量資料結果經統計學檢驗符合正態分布，采用表示，各指標間比較采用多因素設計的方差分析，組內不同時間點比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肝臟 iNKT 細胞頻率及亞群的變化

2.1.1 肝臟iNKT細胞頻率及亞群頻率變化 組間比較發現，與對照組相比，靜脈注射α-GalCer可引起肝臟iNKT細胞頻率及亞群頻率變化，且差異有統計學意義（F=198.40，P＜0.001）。組內比較發現，對照組肝臟iNKT細胞頻率及亞群頻率變化與時間節點無關（P＜0.05）；靜脈注射α-GalCer可引起肝臟iNKT細胞及亞群頻率隨時間推移呈波動性變化（P＜0.05）。觀察組不同時間點iNKT細胞頻率比較差異有統計學意義（F=5.46，P=0.003）。靜脈注射α-GalCer 第2天可使肝臟iNKT細胞達到較高水平，于第4天降至低于正常水平，隨后逐漸恢復至正常水平（P＜0.05）。與第2天相比，第4、6、8 和10天iNKT細胞頻率均顯著降低，均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 小鼠肝臟iNKT細胞頻率變化/（%，）

表1 小鼠肝臟iNKT細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P＜0.05。

組別對照組觀察組第10天3.14±0.35 2.51±0.11①鼠數6 6第2天2.72±0.19 20.87±2.15第4天2.72±0.19 5.61±0.51①第6天2.93±0.24 2.65±0.26①第8天3.06±0.45 2.62±0.64①

2.1.2 肝臟iNKT1亞群細胞頻率變化 觀察組iNKT1亞群細胞頻率在各時間點的比較差異有統計學意義（F=7.19，P=0.001）。靜脈注射α-GalCer可使肝臟iNKT1亞群頻率降至低于正常水平，且隨時間延長呈現上下波動，與第2天相比，第4天iNKT1亞群頻率降低（P＜0.05），第6天iNKT1亞群頻率升高（P＜0.05），第8天iNKT1亞群頻率再次降低（P＜0.05），直至第10天iNKT1亞群頻率恢復至正常水平（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠肝臟iNKT1細胞頻率變化/（%，）

表2 小鼠肝臟iNKT1細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P＜0.05。

組別對照組觀察組第10天3.12±0.11 3.25±0.53①鼠數6 6第2天3.68±1.02 1.04±0.37第4天2.74±0.21 0.48±0.12①第6天2.81±0.33 1.99±1.04第8天2.93±0.29 0.60±0.11

2.1.3 肝臟iNKT2亞群細胞頻率變化 觀察組各時間點iNKT2亞群細胞頻率間差異有統計學意義（F=5.79，P=0.002）。iNKT2亞群細胞頻率于注射α-Gal-Cer后第2天達到較高水平，后逐漸下降，與第2天相比，各時間點iNKT2亞群頻率均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 小鼠肝臟iNKT2細胞頻率變化/（%，）

表3 小鼠肝臟iNKT2細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P＜0.05。

組別對照組觀察組第10天36.37±1..18 6.26±1.28①鼠數6 6第2天38.03±1.70 75.13±3.48第4天40.13±3.20 33.83±9.08①第6天40.16±3.15 17.20±5.37①第8天38.03±1.70 12.00±1.99①

2.1.4 肝臟iNKT17亞群細胞頻率變化 觀察組各時間點iNKT17亞群細胞頻率間的差異有統計學意義（F=4.02，P=0.012）。靜脈注射α-GalCer可使肝臟iNKT17亞群頻率低于正常水平，隨后逐漸恢復，與第2天比較，第4和10天肝臟iNKT17亞群頻率均顯著提高（P＜0.05）。第6和8天略有提高，但差異無統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 小鼠肝臟iNKT17細胞頻率變化/（%，）

表4 小鼠肝臟iNKT17細胞頻率變化/（%，）

注：①與第2天相比，P＜0.05。

組別對照組觀察組第10天4.17±0.14 2.72±1.09①鼠數6 6第2天4.53±1.29 0.17±0.06第4天4.35±1.29 4.13±1.08①第6天3.11±0.33 1.44±0.45第8天3.90±0.33 1.17±0.26

2.1.5 各時間點肝臟iNKT17各亞群細胞頻率變化 第2、4天觀察組與對照組的iNKT細胞頻率相比，差異有統計學意義；除第10天外，其他時間點觀察組iNKT1亞群細胞頻率與對照組差異有統計學意義（P＜0.05）；除第4天外，其他時間點iNKT2及iNKT17亞群細胞頻率與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 不同時間血清細胞因子的變化情況 與第2天相比，觀察組靜脈注射α-GalCer后IL-4水平于第6天降低； IFN-γ水平于第6天和第8天降低；IL-17A水平于第8天升高，均差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組第6天IL-4水平比較，差異有統計學意義；兩組各時間點IFN-γ濃度比較，差異有統計學意義；除第6天外，兩組IL-17A的濃度差異有統計學意義。見表5。

表5 兩組小鼠外周血血清細胞因子濃度比較/（ng/L，）

表5 兩組小鼠外周血血清細胞因子濃度比較/（ng/L，）

注：IL-4為白細胞介素-4，IFN-γ為干擾素-γ，IL-17A為白細胞介素-17A。①與觀察組第2天 相比，P＜0.05。

類別IL-4對照組觀察組IFN-γ對照組觀察組IL-17A對照組觀察組鼠數第2天第6天第8天F值72.14 P值＜0.001 6 6 6 6 6 6 32.38±0.45 33.42±1.67 43.50±0.56 31.64±1.61①32.89±0.78 32.30±1.12 2 768.42＜0.001 403.56±6.18 143.00±15.59 84.47±6.41 59.19±3.57①52.79±0.96 100.07±2.78①199.16＜0.001 47.25±1.67 32.81±0.96 33.64±2.09 33.64±2.40 52.78±0.46 41.97±1.74①

3 討論

最新研究顯示，iNKT細胞可分為四個主要亞群包括iNKT1、iNKT2、iNKT17和iNKT10，目前普遍認為，肝臟和脾臟中主要包含iNKT1亞群，iNKT2亞群則主要分布在胸腺、脾臟和肺中，iNKT17亞群主要存在于淋巴結、肺和皮膚中，iNKT10為近幾年在脂肪組織中發現的一種新的iNKT亞群［12］。本研究主要檢測了肝臟中的iNKT1、iNKT2、iNKT17三種亞群，結果顯示肝臟中iNKT2亞群頻率高于iNKT1亞群，與多數研究不符。之前有一項研究發現［13］，iNKT細胞在自然活化狀態下能夠抑制肝臟炎性介質的增多與聚集從而達到保護肝組織的目的，這說明機體在正常情況下，是處于保護機體的狀態，能夠通過某種機制控制炎癥因素的產生與擴大，因此本實驗中對照組小鼠肝臟iNKT2亞群頻率高于iNKT1亞群，可能是小鼠處于對自身機體的保護狀態下。

靜脈注射α-GalCer后，肝臟iNKT1亞群低于正常水平，后逐漸升高，于第10天升至正常水平；iNKT2亞群高于正常水平，但隨時間逐漸下降；iNKT2亞群頻率始終高于iNKT1亞群。而以往有實驗研究顯示，靜脈注射α-GalCer能使脾臟和肝臟中的NKT1細胞被激活［14］。可能是因為此次實驗中正常情況下時iNKT2亞群就高于iNKT1亞群，再加上注射α-GalCer后，機體對于抗原的侵入所做出的應答為抑炎效應大于促炎效應。許多研究表明，iNKT細胞在激活后很快（在8～12 h內）變得不可檢測［15］，其TCR受體在8～12 h時下調最為明顯，之后表達水平再次升高，在24～48 h時恢復正常水平。因此，iNKT1亞群頻率的下調，可能是因為其表面的TCR受體下調，導致其被檢出受限，并非真正數量上的減低。

iNKT17細胞亞群主要分布在淋巴結、肺和皮膚等組織中，在肝臟、脾臟等組織中含量較低，正常對照組中，iNKT17亞群頻率低于iNKT1亞群和iNKT2亞群，在注射α-GalCer后iNKT17亞群頻率也始終低于正常對照組，可能與此有關［16］。另外在我們前期的一項研究中［17］，通過單次及多次尾根皮下注射α-GalCer，觀察各個臟器iNKT細胞及亞群的變化，結果顯示注射α-GalCer后能誘導iNKT 細胞明顯增殖，各器官中的iNKT亞群變化也有較大差異，這兩項實驗均說明不僅iNKT細胞的分布具有器官組織特異性，iNKT對于刺激做出反應進而向不同亞群分化時，在不同組織中也有著較大差異，也進一步說明iNKT細胞亞群的器官組織定位以及所產生細胞因子的種類和運作方式的重要性。

iNKT細胞是先天性淋巴細胞，聯系著先天性免疫和適應性免疫。與適應性免疫細胞相比，它們具有成熟的效應表型，使其能夠快速對刺激做出應答。本研究中，靜脈注射α-GalCer后第2天，iNKT細胞的頻率即迅速升高，除iNKT細胞能迅速對刺激做出應答的原因外，還可能與靜脈注射的方式有關，靜脈給藥途徑是將物質輸送到動物體內的最有效途徑，藥物能迅速進入血液，起效快［18］，另外由于在血液中代謝較快，靜脈注射抗原免疫應答持續時間短，也就導致結果變化較為迅速。

iNKT1細胞在激活時主要分泌IFN-γ；iNKT2細胞則主要產生IL-4、IL-13和IL-5；iNKT17細胞分泌大量IL-17［5］。分泌IFN-γ的iNKT細胞和分泌IL-17的iNKT細胞可促進肝臟炎癥的病理進程，分泌IL-4的iNKT細胞則發揮抑制炎性反應的作用。觀察組血清IFN-γ自注射后即低于正常水平（P＜0.05），到第8天超過正常水平（P＜0.05），與iNKT細胞亞群的變化一致。在一項來自幼稚小鼠的離體iNKT細胞的分析中顯示［19］，在體內暴露于抗原的2 h內，肝臟中的大多數iNKT細胞就會同時產生IL-4和IFN-γ。而本實驗中顯示血液中IL-4和IFN-γ水平的變化有著明顯的時間差異，這說明iNKT細胞激活后，組織中的細胞因子與血液中的細胞因子可能在數量及種類上有著不同程度的差異，加上本實驗采集外周血的時間與注射時間間隔較長，導致未能及時捕捉到血液中細胞因子初始的變化情況，所以，外周血血清中的細胞因子水平與組織中iNKT細胞的增殖活化的關系尚需進一步研究探討。

IL-17家族有A～F六個成員，其中關于IL-17A的研究較多［20］，實驗結果顯示，觀察組IL-17A水平一直低于對照組，IL-17A是一種參與慢性炎癥的促炎因子，在一項由α-GalCer誘導的急性肝功能衰竭的模型中發現，IL-17的分泌增加在加快疾病進展方面起著重要作用［21］。再次說明此實驗中小鼠對于抗原刺激所產生的效應以保護機體為主。

α-GalCer等外源性糖脂類抗原刺激體內iNKT細胞，使其能夠迅速產生IL-4和IFN-γ。有研究表明，靜息的iNKT細胞具有高水平的IL-4和IFN-γ mRNA，在高水平表達IL-4和IFN-γ mRNA的T細胞中存在的一種識別基序家族RNA結合蛋白TIA-1和TIAR的編碼mRNA，同樣存在于iNKT細胞中，同時還發現編碼趨化因子RANTES（CCL5）的mRNA在iNKT細胞中具有組成性表達［22-23］。這些發現表明，iNKT調節其細胞因子分泌的機制可能在某種程度上與之有關，這也可能是細胞能做出快速反應的原因之一。但它是否適用于iNKT細胞產生的所有細胞因子及趨化因子，以及它們具體的作用機制，是我們下一步需要研究探討的問題。

iNKT細胞和細胞因子、趨化因子、其他免疫細胞及免疫組織微環境等互相交織成一張復雜的免疫網絡，其功能的多樣性提示我們它在機體中發揮作用的復雜性，α-GalCer重復處理會導致無能，有研究依據iNKT細胞功能的雙面性，設計了一種“雙重打擊”的方法治療膿毒血癥，使iNKT細胞能夠逃脫無能并在雙相敗血癥中發揮有益作用［24］。這說明合理利用iNKT細胞的免疫雙重功能來治療疾病是未來一大熱點。

綜上所述，靜脈注射α-GalCer能促進小鼠肝臟iNKT細胞的增殖，誘導iNKT 細胞各亞群的變化，本實驗為肝臟疾病的基于iNKT細胞的免疫治療提供了基礎研究依據。