光化性角化病病人皮膚組織Toll樣受體7蛋白表達及其臨床意義

劉珈言，李二龍，梅蓉，楊禮鳳，趙文彬，韓成龍，周慧

作者單位：四川大學華西醫院皮膚性病科，四川 成都610041

光化性角化病（actinic keratosis，AK）是一類由長期日照或電離輻射導致的以皮膚表皮角化過度為主的皮膚病，多發于老年人與長期日曬群體［1］。既往報道表明［2］，AK是最常見的一種皮膚癌前病變，易發展為皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC），進而侵襲骨骼、肌肉等組織，甚至威脅病人生命。目前AK發展為cSCC的發病機制尚不明確，故探討影響AK發展為cSCC的可能因素對臨床治療改善AK病人預后十分重要。李莎［3］等研究表明，Toll樣受體7（toll like receptor 7，TLR7）蛋白是一種主要分布于免疫細胞的天然免疫受體蛋白，其可誘導機體的免疫反應，引發炎癥，可能參與了AK的發病過程，其表達量隨表皮病變惡化程度增加而上漲；此外，腫瘤與癌前病變會引發機體強烈的天然免疫，致使效應分子TLR7蛋白水平上調，而TLR7引發的持續性炎癥會進一步促進腫瘤發展［4］，提示TLR7的表達可能與AK發展為cSCC存在一定的相關性。鑒于此，本研究特選取134例AK病人，探究其皮膚組織中TLR7蛋白的表達量與預后情況之間的關系，并分析AK病人皮膚組織中TLR7蛋白表達對其預后的預測效能，以期為AK病人的預后分析和早期治療提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2019年1月四川大學華西醫院134例AK病人的皮損皮膚蠟塊標本作為觀察組，選取同時期收集的129例健康人員的皮膚蠟塊標本作為對照組。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

納入標準：①觀察組均符合《臨床皮膚病學》［5］中AK的診斷表準，且均經病理學檢查確診；②AK病人確診后均行激光-光動力療法治療；③受試者或其近親屬對本研究知情同意。排除標準：①合并其他良惡性腫瘤；②脂溢性角化、基底細胞癌等其他皮膚疾病；③皮膚組織獲取前3個月內進行過治療。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織TLR7檢測方法 蠟塊均連續4 μm切片，切片進行常規脫蠟水化，0.01 mol/L PBS沖洗，置于0.01 mol/L枸櫞酸液（武漢博士得生物工程有限公司）中浸泡后，微波爐高火修復13 min，再冷卻，PBS沖洗5 min，3%雙氧水37 ℃孵育20 min，滴加正常山羊血清37 ℃封閉30 min，舍去血清，加入一抗兔抗人TLR7抗體（1∶50稀釋）與鼠抗人TLR8抗體（1∶100稀釋）后，4℃冰箱中孵育過夜。次日取出37 ℃復溫60 min，加入生物素標記的二抗孵育0.5 h，辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液37 ℃ 0.5 h，PBS沖洗，DAB染色后，沖水10 min，蘇木精復染1 min，脫水，透明后，滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2 TLR7表達量確定 片狀棕黃色染色為陽性表達，通過計算機Image pro Plus 6.0（IPP）軟件分析圖片，選擇圖片著色最密集最深的區域為基礎，計算陽性細胞的積分光密度值（integrated option density，IOD），OID越高，TLR7蛋白表達越高。

1.2.3 AK病人預后情況判斷劑分組 對觀察組病例病人均隨訪3年，將發展為cSCC者歸為癌變組，未發展為cSCC者歸為非癌變組。

1.2.4 可能癌變組因素分析 比較分析可能導致AK病人癌變組的因素，包括年齡、性別、皮膚病史、病程、病理類型（肥厚型、萎縮型、原位癌樣型）、Fitzpatrick皮膚分型以及皮膚組織TLR7蛋白表達量等，分析影響因素。

1.3 觀察指標 （1）比較觀察組和對照組一般資料及皮膚組織中TLR7蛋白的表達水平。（2）比較非癌變組與癌變組皮膚組織TLR7蛋白的表達水平。（3）癌變組因素logistic分析：比值比（OR）、95%可信區間（95%CI）。（4）皮膚組織TLR7蛋白表達量對AK發展為cSCC的預測效能：記錄截斷值、靈敏度、特異度、受試者操作特征（ROC）曲線下面積和95%CI。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件處理數據，計量資料采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗；對AK病人癌變的可能影響因素開展logistic回歸分析，同時采用Hosmer-Lemeshow法對模型進行檢驗并對影響因素進行共線性診斷。采用ROC曲線分析皮膚組織中TLR7蛋白表達水平對AK發展為cSCC的預測效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組一般資料比較 觀察組病程（26.08±5.11）月，其中肥厚型79例（58.96%），萎縮性22例（16.42%），原位癌樣型33例（24.63%），單發皮損111例（82.84%），多發皮損23例（17.16%）。觀察組和對照組性別、年齡、部位比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 光化性角化病和對照組一般資料比較

2.2 觀察組與對照組皮膚組織TLR7蛋白表達水平比較 觀察組的皮膚組織中TLR7蛋白表達量（23.76±3.90）高于對照組表達量（4.95±0.64），差異有統計學意義（t=54.08，P＜0.05）。

2.3 癌變組與非癌變組的皮膚組織TLR7蛋白表達水平比較 134例AK病人隨訪3年發生癌變21例，未發生癌變113例，癌變率為15.67%。癌變組的皮膚組織中TLR7蛋白表達量（27.37±3.19）高于非癌變組（23.08±3.66），差異有統計學意義（t=5.02，P＜0.05）。

2.4 AK病人癌變的影響因素分析 癌變組與非癌變組皮膚病史、病理類型、病程、皮損數量對比差異無統計學意義（P＞0.05）；癌變組病人的年齡大于非癌變組（P＜0.05），男性、Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型的病人占比及TLR7蛋白表達量均高于非癌變組（P＜0.05），見表2。

表2 光化性角化病癌變的單因素分析結果

經Hosmer-Lemeshow檢驗，logistic模型的觀測值和期望值差異無統計學意義（χ2=4.75，P=0.596），說明該模型的擬合度良好。logistic回歸分析結果顯示，高齡、男性、Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型、皮膚組織中TLR7蛋白高表達均是AK病人癌變組的危險因素（P＜0.05），對篩選出的4個有統計學差異的變量進行共線性診斷，結果顯示4個變量的方差膨脹因子（VIF）均＜10，說明自變量之間無共線性存在，具體數值見表3。

表3 共線性診斷和logistic回歸分析結果

2.5 皮膚組織TLR7蛋白表達量對AK癌變組的預測效能 皮膚組織TLR7蛋白表達量預測AK病人預后情況的ROC曲線見圖1，截斷值為25.34，靈敏度為80.95%，特異度為81.42%，ROC曲線下面積為0.81，95%CI：（0.74，0.88）。

3 討論

AK是臨床常見的一種損害性癌前皮膚病，在我國的發病率約為0.7%，其中約有0.025%～16.000%的AK病人會在后期發展為cSCC［6］。cSCC具有浸潤性、轉移性、發展快、惡性程度高等特點，病人預后較差，嚴重威脅病人的健康［7］。目前，AK發展為cSCC的發病機制尚不明確，影響因素繁多，但鮮有對其影響因素的分析報道，故全面分析篩選AK發展為CSCC的影響因素對AK病人的早期干預和預后改善十分必要。

本研究顯示，觀察組病人皮膚組織中TLR7蛋白表達量高于對照組，說明TLR7蛋白在AK病人的皮膚組織中呈現異常高表達。TLR7作為TLR家族成員之一，具有與其他TLR相似的結構特征與功能作用，可通過識別細菌、病毒等外源配體的基因組DNA，促使免疫細胞分泌釋放干擾素-α等炎性因子而發生免疫反應。AK病人的皮膚角質細胞已發生明顯損傷，受損皮膚易被細菌、病毒感染而誘發上皮細胞中TLR7蛋白表達［8-9］，同時釋放出大量干擾素-α，進一步促使B細胞內TLR7表達上調［10］，INF-α與TLR7表達之間的正反饋調節機制［11］致使AK病人的皮膚組織中TLR7表達水平顯著升高。此外，本研究顯示，癌變組皮膚組織TLR7蛋白表達水平高于非癌變組，且經logistic回歸分析證實TLR7是AK病人癌變組的獨立危險因素。既往研究［12-13］發現，在宮頸鱗癌、惡性上皮腫瘤病人中，TLR7蛋白發揮促腫瘤的作用。TLR的信號通路會顯著影響腫瘤的發生與進展，腫瘤細胞表面活化的TLR7會促使核因子-kB水平上調，促使抗凋亡蛋白表達，進而誘發腫瘤［14］；此外，TLR7可調控腫瘤細胞對細胞因子和趨化因子分泌釋放，誘導免疫細胞分泌炎性因子，從而削弱抗原提呈細胞和效應T細胞的抗腫瘤，引發“免疫逃逸”，導致腫瘤的惡性程度隨TLR7表達水平的升高而升高［15］，因而AK病人皮膚組織TLR7蛋白表達水平越高，病人后期進展為cSCC的概率越大。于麗麗等［16］發現子宮內膜癌病人癌組織中TLR7表達水平明顯高于不典型增生組織，且表達水平越高，預后越差；Liotti等［17］報道，非小細胞肺癌病人TLR7的表達水平升高；本研究與上述研究結果一致，均表明TLR7高表達與腫瘤發生相關。

此外，logistic回歸分析結果顯示高齡、男性、Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型均是AK病人癌變組的獨立危險因素。究其原因：可能是高齡病人機體免疫功能減退，對腫瘤的發生與發展的抵抗能力下降；男性病人暴露于紫外線下的時間更長，皮膚病變程度更嚴重；Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型病人皮膚黑色素水平較低，對紫外線敏感程度高，更易引發皮膚病變。此外，本研究顯示皮膚組織TLR7蛋白表達量預測AK病人預后情況的ROC曲線的靈敏度為80.95%，特異度為81.42%，ROC曲線下面積為0.81，表明其對AK病人的預后具有良好的預測效能。臨床上可通過早期檢測AK病人皮膚組織中TLR7蛋白的表達水平，及時篩選可能發生癌變組的AK病人，及早地實施干預治療，對cSCC的預防具有重要的臨床意義。

皮膚組織TLR7蛋白表達量對AK病人的預后具有良好的預測效能，是臨床預判AK病人預后的有效方法，具有重要臨床應用價值。但本研究仍存在一定的局限性，首先AK樣本量選取較少，其次對于預后進展的隨訪時間僅有3年，缺乏更遠期預后情況分析，仍需大樣本的前瞻性研究進行長期隨訪驗證結果。