異鼠李素通過上調自噬水平預防巨噬細胞脂質代謝紊亂

王婷婷，張鵬珂，史敏，于倩怡，喬嬌，薛玉剛

急性心肌梗死是動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要并發癥，其致死率較高，為13.2%［1］。鑒于不穩定斑塊的治療策略有限，有必要開發新的治療手段來預防斑塊形成，而不是治療已經形成的斑塊［2］。動脈粥樣硬化的形成主要是由于巨噬細胞中脂質代謝紊亂，導致脂質轉運出巨噬細胞發生障礙及巨噬細胞中存在多余的脂質沉積，進而導致泡沫細胞的形成［3］。而泡沫細胞在血管內皮下的不斷形成及積聚可促進斑塊的形成和進展，且脂質核心不斷擴大可導致不穩定斑塊的形成［4］。因此，探討糾正巨噬細胞中脂質代謝紊亂從而抑制泡沫細胞形成的機制有助于抑制不穩定斑塊的形成，從而降低急性心血管事件的發生率。

異鼠李素是一種主要從大量果實、花等植物中提取的黃酮類化合物，研究發現，其具有降血脂、擴張冠狀動脈、抗氧化等重要作用［5］。研究顯示，真核細胞中維持細胞器和蛋白質穩態的一種重要的細胞過程被稱為“自噬”［6］。本研究組前期研究發現，異鼠李素可通過升高SIRT6來減輕巨噬細胞脂質代謝障礙，進而抑制泡沫細胞形成［7］，但自噬是否參與這一病理過程目前尚不得而知。基于此，本研究旨在探討異鼠李素預防巨噬細胞脂質代謝紊亂的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2022年1—6月。

1.2 實驗細胞 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7細胞）購自美國ATCC公司。

1.3 主要實驗試劑與儀器 異鼠李素（批號：MED80003，純度≥9 8%）購自湖南康都制藥有限公司，氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）購自廣州市益源生物科技有限公司，微管相關蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）Ⅱ抗體（貨號：AB192890）、P62抗體（貨號：AB109012）、GAPDH抗體（貨號：#8864S）購自美國CST公司，山羊抗兔IgG二抗購自西安壯志生物科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養及分組 采用含有15%胎牛血清的細胞培養基培養RAW264.7細胞，培養環境為消毒滅菌細胞孵箱。取對數生長期的RAW264.7細胞，將其分為對照組（不干預）、動脈粥樣硬化組（采用50 μg/ml的ox-LDL干預24 h［8］）、動脈粥樣硬化+異鼠李素組（采用20 μmol/L的異鼠李素孵育8 h，之后采用50 μg/ml的ox-LDL干預24 h）。

1.4.2 油紅O染色檢測巨噬細胞中脂質含量 收集各組RAW264.7細胞，固定15 min后根據試劑盒說明書進行油紅O染色，然后在倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞中脂質含量。實驗獨立重復3次。

1.4.3 Western blot法檢測巨噬細胞中自噬標志物（LC3Ⅱ、P62）表達水平 收集各組RAW264.7細胞，用PBS洗滌并充分消化，提取蛋白后進行聚丙酰胺凝膠電泳，并轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；加入LC3Ⅱ、P62、GAPDH抗體（實驗中所需LC3Ⅱ、P62、GAPDH抗體提前按1∶100的比例配好），用脫脂奶粉封固后于4 ℃冰箱中孵育過夜；滴加山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，采用化學發光法、利用BIORAD凝膠成像系統檢測巨噬細胞中LC3Ⅱ、P62表達水平。實驗獨立重復3次。

1.4.4 透射電鏡觀察巨噬細胞中自噬小體數目 收集各組RAW264.7細胞，送往空軍軍醫大學口腔醫院電鏡室制備標本，在透射電鏡下觀察自噬小體數目。實驗獨立重復3次。

1.5 統計學方法 采用Graphpad Prism 5.01軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差有統計意義。

2 結果

2.1 巨噬細胞中脂質含量 油紅O染色結果顯示，對照組巨噬細胞中未發現脂質沉積；動脈粥樣硬化組巨噬細胞中存在明顯的脂質沉積現象；與動脈粥樣硬化組比較，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中脂質含量明顯減少，見圖1。

圖1 油紅O染色檢測各組巨噬細胞中脂質含量（×200）Figure 1 Lipid content of macrophages in each group detected by oil red O staining

2.2 巨噬細胞中自噬標志物表達水平 三組巨噬細胞中LC3Ⅱ、P62表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平低于對照組，P62表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平高于動脈粥樣硬化組，P62表達水平低于動脈粥樣硬化組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組巨噬細胞中自噬標志物表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of autophagy markers of macrophages in three groups

表1 三組巨噬細胞中自噬標志物表達水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of autophagy markers of macrophages in three groups

注：LC3=微管相關蛋白1輕鏈3；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與動脈粥樣硬化組比較，P＜0.05

組別LC3ⅡP62對照組1.000±0.0531.000±0.062動脈粥樣硬化組0.193±0.136a4.086±0.436a動脈粥樣硬化+異鼠李素組0.586±0.096ab2.273±0.105ab F值159.60351.60 P值＜0.001＜0.001

2.3 巨噬細胞中自噬小體數目 透射電鏡觀察結果顯示，對照組巨噬細胞中可觀察到自噬小體；與對照組相比，動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數目明顯減少；與動脈粥樣硬化組相比，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數目增多，見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組巨噬細胞中自噬小體數目Figure 2 The number of autophagosomes in macrophages in each group observed by transmission electron microscopy

3 討論

心血管疾病是影響全世界人民健康的最主要問題之一，患者死亡率很高，因而早期預防和治療心血管疾病尤為重要，而動脈粥樣硬化是心血管疾病最常見的原因之一［9］。眾所周知，動脈粥樣硬化的形成是一個復雜的病理過程，包括脂質代謝紊亂、炎癥、氧化應激、自噬功能障礙和線粒體功能障礙，其中脂質代謝紊亂發揮著關鍵作用［9］。巨噬細胞攝取脂質與清除脂質的作用失衡將導致多余的脂質積聚，從而引發脂質代謝紊亂，進而導致泡沫細胞形成［10-11］；此外，脂質超負荷會阻礙巨噬細胞從斑塊中遷移，導致其發生凋亡和壞死，從而加重斑塊的不穩定性［12］。因此，糾正巨噬細胞脂質代謝紊亂是抑制動脈粥樣硬化斑塊形成的有效方法。既往研究發現，異鼠李素具有減輕氧化應激導致的內皮功能障礙等多種生物學作用［2］，異鼠李素抗動脈粥樣硬化的作用主要體現在抑制ox-LDL形成、內皮細胞損傷、脂質堆積、平滑肌細胞增殖及遷移等［13］，然而其具體機制尚不清楚。本研究組前期研究發現，異鼠李素可減輕巨噬細胞脂質代謝障礙，進而抑制泡沫細胞形成［7］。本研究旨在探討異鼠李素預防巨噬細胞脂質代謝紊亂的具體機制。

本研究油紅O染色結果顯示，對照組巨噬細胞中未發現脂質沉積；動脈粥樣硬化組巨噬細胞中存在明顯的脂質沉積現象；與動脈粥樣硬化組比較，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中脂質含量明顯減少；提示異鼠李素可以減少脂質在巨噬細胞中的沉積，進而預防泡沫細胞的形成。

研究發現，遺傳、飲食和藥物均可以激活自噬，而自噬功能障礙會導致動脈粥樣硬化，進而引起心血管疾病［14］。自噬功能障礙可發生在各種類型細胞中，主要為血管平滑肌細胞、內皮細胞和巨噬細胞，其中巨噬細胞自噬功能障礙在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中發揮著重要作用［15］。研究顯示，自噬底物P62可連接LC3和泛素化的底物，隨后被整合到自噬體中，并在自噬溶酶體中被降解［9］。本研究結果顯示，動脈粥樣硬化組、動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平低于對照組，P62表達水平高于對照組；動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中LC3Ⅱ表達水平高于動脈粥樣硬化組，P62表達水平低于動脈粥樣硬化組，提示異鼠李素能夠上調巨噬細胞中自噬水平。此外，本研究透射電鏡觀察結果顯示，對照組巨噬細胞中可觀察到自噬小體；與對照組相比，動脈粥樣硬化組和動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數目明顯減少；與動脈粥樣硬化組相比，動脈粥樣硬化+異鼠李素組巨噬細胞中自噬小體數目增多，提示異鼠李素能夠增加巨噬細胞中自噬小體的數目。以上研究結果表明，異鼠李素可能通過上調巨噬細胞自噬水平來促進脂質通過自噬-溶酶體途徑進行降解，從而減少脂質沉積，預防脂質代謝紊亂，進而預防泡沫細胞形成。

綜上所述，異鼠李素可能通過上調巨噬細胞自噬水平來預防脂質代謝紊亂，進而預防泡沫細胞形成。本研究為抑制動脈粥樣硬化斑塊形成、促進斑塊穩定性提供了新的治療方向。但本研究為基礎研究，尚需要臨床試驗進一步驗證本研究結論。此外，臨床上冠心病合并糖尿病患者常同時存在糖脂代謝紊亂［16］，異鼠李素是否可通過上調巨噬細胞自噬水平來調控糖脂代謝紊亂還需要進一步研究。

致謝：感謝空軍軍醫大學口腔醫院的老師對本實驗給予的技術支持及設備支持。

作者貢獻：王婷婷、薛玉剛進行研究的構思與設計、可行性分析及文章的撰寫，負責文章的質量控制及審校；王婷婷、張鵬珂進行文章的修訂；于倩怡、喬嬌進行數據收集、整理；史敏進行結果分析與解釋；薛玉剛對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。