液質聯用檢測奶茶中三聚氰胺基質效應的研究及消除

景贊，呂雪梅，劉超

樂山市食品藥品檢驗檢測中心（樂山 614000）

三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物[1]，是一種化工原料，禁止添加到食品中。在世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單初步整理參考中，三聚氰胺就在2B類致癌物清單中[2]。

三聚氰胺的檢測方法主要有重量法、電位滴定法、高效液相色譜法、氣質聯用法和液質聯用法[3-5]等。液質聯用法測定復雜基質時具有選擇性好、分析效率高、靈敏度高、定性能力強、定量準確等優點[6-7]，因此廣泛應用于食品分析中。但液質聯用檢測食品中三聚氰胺時存在顯著的基質效應，必須采取有效的措施減弱或消除基質效應才能夠得到準確的結果[8]。

基質效應是指因目標分析物不穩定或基質中干擾組分讓目標分析物發生改變，如聚合、酯化等，或者是干擾組分與目標分析物的保留時間相同，干擾組分弱化了目標分析物的離子化[9-11]。試驗通過液質聯用技術研究了奶茶中三聚氰胺基質效應的影響因素，采用內標法[13-15]消除檢測過程中的基質效應，為進一步尋找消除基質效應，提高LC-MS/MS分析測定乳制品中三聚氰胺殘留結果的準確度與精確度提供了方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

DGU-20 A-API 3200高效液相色譜-串聯質譜儀（AB SCIEX公司）；HSC-B氮吹儀（廣市錦卓儀器設備有限公司）；KQ-1 000 VDE數控超聲波清洗機（昆山舒美超聲儀器有限公司）；JRY 12固相萃取儀（湖南金蓉儀器設備有限公司）；ES-E 120 B II電子天平（天津市德安特傳感技術有限公司）；FUP PT 18 H高速冷凍離心機（青島法特通訊科技有限公司）；SHA-B數顯恒溫水浴振蕩器（唐山力辰科技有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL，沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純）：成都市諾爾施科技有限責任公司；三氯乙酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；三聚氰胺標準品（99.0% Lot：G 133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內標標準品（Melamine-13 C 3 100 μg/mL 壇墨質檢科技股份有限公司）；水（實驗室一級用水）；奶茶：香飄飄奶茶：香飄飄食品股份有限公司、阿薩姆奶茶：統一集團有限公司、麥德龍紅茶拿鐵奶茶：麥德龍商業集團有限公司、立頓奶茶：聯合利華（中國）有限公司、良品鋪子港式奶茶：良品鋪子股份有限公司、立頓速溶固體抹茶原味奶茶：聯合利華（中國）有限公司、天美華乳速溶奶茶：天美華乳食品有限責任公司、鹿角袋手工現泡奶茶：臺灣鹿角巷奶茶有限公司。

1.3 樣品處理

奶茶中三聚氰胺的提取、凈化參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》[16]“4.4.1.1小節”、“4.4.2小節”處理。

1.4 三聚氰胺標準儲備液

準確稱取10 mg三聚氰胺標準品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標準及內標中間液

三聚氰胺標準中間液：準確移取25 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

三聚氰胺內標中間液：準確移取250 μL三聚氰胺標準儲備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質譜/質譜檢測條件

1.6.1 液相條件

色譜柱：CAPCELL PAK CR（1∶4，150 mm×2.0 mm，5 μm）

流動相：乙酸銨溶液-乙腈1∶1（V/V），用乙酸調至pH 3；進樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min。

1.6.2 質譜條件

掃描方式：電噴霧正離子掃描；IS：4 500 V；GS1：30 psi；GS2：30 psi；溫度：450 ℃。

1.7 基質效應評價方法

運用定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應程度，通過式（1）計算二者比值來評價基質效應。

式中：A和B為基質溶液和純溶劑分析物的峰面積。當A/B＜80%時，對分析物的響應產生抑制作用；當A/B＞120%，對分析物的響應產生增強作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質效應。

1.8 統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 取樣量對基質效應的影響

分別稱取0.50 g和1.00 g（精確至0.01 g）不同種類的奶茶，按照“1.3小節”進行溶劑的提取和凈化，處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A、B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對基質效應是否有顯著性影響，結果見表2和圖1。

圖1 取樣量對8種奶茶中三聚氰胺基質效應的影響

表2為取樣量對三聚氰胺基質效應的統計分析結果。由表1可知，雪奶茶中P值均＜0.05，表明取樣量對三聚氰胺的基質效應存在顯著性差異，有明顯的基質效應，因此取樣量是影響奶茶三聚氰胺基質效應的主要因素之一，原因可能為奶茶的制作工藝不同或奶茶的廠家原料不同。由圖1可知，取樣量為0.50和1.00 g時，奶茶的三聚氰胺基質效應為27.84%～39.19%和16.06%～27.62%之間。

表1 三聚氰胺及其內標質譜參數

表2 取樣量對三聚氰胺基質效應的影響

2.2 溶劑種類對基質效應的影響

分別稱取4份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），每個種類奶茶的4份樣品中分別加入10 mL水、6 mL乙腈-4 mL水、10 mL三氯乙酸（1%）以及8 mL三氯乙酸（1%）-2 mL乙腈，按照“1.3小節”進行溶劑的提取和凈化，處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A、B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察溶劑種類對基質效應是否有顯著性影響，結果見表3和圖2。

圖2 溶劑種類對奶茶中三聚氰胺基質效應的影響

表3 溶劑種類對三聚氰胺基質效應的影響

由表3可知，奶茶中P值均＜0.05，表明溶劑種類對三聚氰胺基質效應存在顯著性差異，有明顯的基質效應，因此溶劑種類是影響奶茶三聚氰胺基質效應的主要因素之一，原因可能為奶茶的制作工藝不同，奶茶的廠家原料不同等。由圖2得，溶劑種類分別為水、乙腈-水3∶2（V/V）、三氯乙酸、三氯乙酸-乙腈4∶1（V/V）時，奶茶三聚氰胺基質效應分別在29.59%～40.82%，22.68%～34.56%，14.25%～26.13%和15.55%～27.21%之間。其中，當溶劑為三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈4∶1（V/V）之間時，對三聚氰胺基質效應無顯著性差異，故這二者之間不存在基質效應。

2.3 溶劑用量對基質效應的影響

分別稱取3份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），每個品種奶茶3份樣品分別加入4 mL三氯乙酸-1 mL乙腈、8 mL三氯乙酸-2 mL乙腈以及12 mL三氯乙酸-3 mL乙腈，按照“1.3小節”進行溶劑的提取和凈化，處理后通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A、B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察溶劑用量對基質效應是否有顯著性影響，結果見表4和圖3。

圖3 溶劑用量對奶茶中三聚氰胺基質效應的影響

表4 溶劑用量對三聚氰胺基質效應的影響

由表4可知，奶茶P值均＜0.05，表明溶劑用量對三聚氰胺基質效應存在顯著性差異，因此溶劑的用量是影響奶茶三聚氰胺基質效應的主要因素之一，產生這種結果的原因可能為生產奶茶的廠家配方不同。由圖3可得，溶劑的用量分別為5，10和15 mL時，奶茶的三聚氰胺基質效應分別為26.82%～39.27%，16.31%～28.11%和12.45%～24.25%之間。

2.4 不同濃度三聚氰胺對基質效應的影響

分別稱取3份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），按照“1.3小節”進行溶劑的提取和凈化，處理后在3份樣品中分別加入10，50和100 μL三聚氰胺中間溶液，通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察不同濃度對基質效應是否有顯著性影響，結果見表5和圖4。

圖4 不同濃度三聚氰胺對奶茶中三聚氰胺基質效應的影響

表5 不同濃度三聚氰胺對三聚氰胺基質效應的影響

由表5可知，奶茶P值均＞0.05，表明不同濃度三聚氰胺對三聚氰胺基質效應沒有產生顯著性差異，無明顯的基質效應，因此不同濃度三聚氰胺不是影響奶茶三聚氰胺基質效應的主要因素之一。

2.5 凈化方式對三聚氰胺基質效應的影響

分別稱取4份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），按照“1.3小節”進行溶劑的提取和凈化，不同種類的奶茶的4份樣品分別按照凈化液不過柱、過WCX固相萃取柱、過Cleanert PCX固相萃取柱，過Bond Elut PCX固相萃取柱的方式處理，以上溶液分別通過LC-MS/MS分析測定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純溶劑分析物的峰面積）。將A和B代入SPSS 20.0軟件，考察不同凈化方式對基質效應是否有顯著性影響，結果見表6和圖5。

圖5 凈化方式對奶茶中三聚氰胺基質效應的影響

圖6 三聚氰胺及其內標一級質譜圖

圖7 三聚氰胺內標二級質譜圖

圖8 三聚氰胺二級質譜圖

表6 凈化方式對三聚氰胺基質效應的影響

由表6可知，過SPE小柱和不過SPE小柱之間有顯著性差異，存在基質效應；而過不同SPE小柱之間無顯著性差異，不存在基質效應，因此凈化方式為影響奶茶三聚氰胺基質效應的影響因素之一。由圖5可知，不過柱、WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX時，奶茶的三聚氰胺基質效應分別在11.45%～23.33%，15.55%～27.43%，14.04%～25.92%和14.90%～26.57%之間。

2.6 基質效應的消除

標準曲線的制備：移取6份體積不同的三聚氰胺標準中間液至25 mL容量瓶中，加入相同體積的三聚氰胺內標工作液，用50%的甲醇水溶液定容至刻度線處，所得樣品溶液質量濃度為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標準工作液，每毫升三聚氰胺標準工作液中含有三聚氰胺內標質量濃度為20 ng/mL，濃度由低到高進樣檢測。以三聚氰胺濃度和三聚氰胺峰面積/內標峰面積作圖，得到標準曲線回歸方程，見表7。

表7 三聚氰胺線性方程

取空白樣品9份至9個50 mL的離心管中，加入20 μL的內標中間液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL的三聚氰胺標準中間液，做三水平三平行回收試驗，按照“1.3小節”提取和凈化處理，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內標峰面積，計算加標回收率。

由表8可知，隨著加標濃度的變化，奶茶中三聚氰胺加標回收率在101%～108%之間，表明方法準確，內標法對三聚氰胺基質效應的消除具有非常顯著的效果，很大程度上消除了基質效應，達到了理想的試驗效果。

表8 奶茶中三聚氰胺加標回收率（n=3）

3 結論

液質聯用檢測奶茶中三聚氰胺基質效應的研究時發現，對于選自不同種類的奶茶，改變取樣量、溶劑的種類、溶劑的用量、不同濃度三聚氰胺和凈化方式，其檢測過程中產生的基質效應相差較為明顯，試驗結果表明：取樣量、溶劑種類[除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈4∶1（V/V）之間外]、溶劑用量、凈化方式對三聚氰胺基質效應均存在顯著性差異，而不同三聚氰胺濃度對三聚氰胺基質效應均無顯著性差異，不存在基質效應。