MIP-SPE-HPLC法測定功能性油脂中15種多環芳烴

鄧龍，周思 ，羅曉燕，黃佳佳

1.廣東食品藥品職業學院（廣州 510520）；2.廣州市疾病預防控制中心（廣州 510440）

多環芳烴（PAHs）是一類具有重大健康危害的持久性有機污染物[1-3]。油脂是人體攝入PAHs的主要來源之一[4-5]。國內外對油脂中的PAHs均有嚴格限量規定[6-7]。功能性油脂作為一類具有調節機體、預防疾病等保健功能的特殊油脂類物質，產品受眾多為嬰幼兒、孕婦、老年人等敏感人群，相關產品中PAHs含量水平檢測暫未見專門報道[6,8]。建立穩定可靠的功能性油脂中PAHs篩查方法、掌握市售功能性油脂產品中PAHs污染現狀并提示風險，可為人群健康及相關限量標準的研究提供參考。15種目標PAHs理化性質參數見表1。

PAHs檢測儀器方法成熟，以氣相色譜-串聯質譜法和高效液相色譜熒光檢測器法為主，后者靈敏度相對更高[9-14]。功能性油脂中PAHs含量水平低和基質干擾嚴重是檢測面臨的主要挑戰，如何進行樣品前處理十分重要。多采用皂化、液液萃取、超聲萃取等提取，凝膠色譜、固相萃取等凈化[14]，操作繁瑣，穩定性和重復性欠佳[15-16]。分子印跡固相萃取（MIPSPE）基于選定的模板分子結構進行識別，實現目標物的高效提取與富集，操作簡單，已應用于不同樣品中PAHs的處理[17-20]。受濃縮過程易損失、印跡模板吸附不牢等因素影響，輕質多環芳烴穩定性與回收率欠佳，仍待進一步研究[9,17,19-20]。

試驗結合分子印跡固相萃取技術與高效液相色譜熒光檢測器法，逐一優化淋洗、洗脫、濃縮等條件，旨在建立一種穩定可靠的功能性油脂中PAHs檢測方法，并對市售功能性油脂產品中PAHs污染水平進行篩查與風險分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能性油脂27款（購于當地商店或電商平臺），包括魚油（4款）、魚肝油（3款）、米糠油（2款）、葡萄籽油（2款）、紫蘇油（1款）、月見草油（2款）、胚芽油（4款）、沙棘子油（1款）、紅花籽油（2款）、鱷梨油（1款）、藻油（3款）、海藻油（2款）。15種多環芳烴標準品（質量濃度2 000 μg/mL，北京壇墨公司）；乙腈、正己烷、二氯甲烷等試劑（色譜純，德國Merck公司）；多環芳烴分子印跡固相萃取柱（500 mg/6 mL，上海安譜科技股份有限公司）；PAH C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters公司）。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY Arc超高效液相色譜儀配熒光檢測器（美國Waters公司）；VORTEX MS3漩渦混合器（德國IKA公司）；FV64全自動智能氮吹儀（廣州得泰公司）；固相萃取裝置（美國Waters公司）；Milli-Q去離子水發生器（美國Millipore公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

目標物用乙腈配制成質量濃度100 mg/L的標準儲備液，于-20 ℃冰箱避光保存。吸取適量標準儲備液，用乙腈稀釋成質量濃度5.00 mg/L的混合標準溶液，于-20 ℃冰箱避光保存。使用時，用乙腈逐級稀釋成質量濃度0.2，0.5，1.0，5.0，10和50 μg/L的系列標準工作溶液。

1.3.2 樣品的提取與凈化

液體樣本混勻后直接取樣，膠囊樣本去殼混勻后取樣，準確稱取0.5 g（精確至0.01 g）樣本于10 mL具塞離心管中，加入3 mL正己烷，漩渦混勻。MIP-SPE柱用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化，將樣品溶液全部轉移至小柱，待自然流出，取6 mL正己烷淋洗，用8 mL二氯甲烷洗脫。洗脫液于帶刻度細底氮吹管25 ℃氮吹至100 μL，加入0.5 mL乙腈復溶，轉移至非針式過濾瓶，待上機測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱PAH C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣量10 μL：柱溫30 ℃；流動相為乙腈-水溶液，流速1.2 mL/min，梯度洗脫程序：初始乙腈60%，15 min升至100%，保持10 min，1 min乙腈降至60%，保持9 min，總時長35 min。熒光檢測器激發-發射波長設置見表2。

2 結果與分析

2.1 淋洗溶劑的優化

功能性油脂含有的大量甘油三酯及脂肪伴隨物是產生基質干擾的主要原因[6]。使用分子印跡材料吸附目標物后，用正己烷淋洗掉樣本基質是減少干擾的關鍵[13]。15種目標PAHs根據苯環數可以分為輕質多環芳烴（LPAHs）、中質多環芳烴（MPAHs）和重質多環芳烴（HPAHs）。由于以LPAHs為模板形成的印跡空腔太小，無法選擇性富集樣品中的中質、HPAHs[21]。商業化分子印跡材料多以4環及4環以上多環芳烴為模板，合成的分子印跡材料對LPAHs的特異性吸附不強，淋洗時容易從印跡空腔中洗脫，導致回收率偏低[17]。需細致優化淋洗溶劑用量，保證回收率同時最大程度減少樣本基質干擾。取0.1 mL質量濃度50 μg/L的PAHs混標溶液加入活化后的MIP-SPE柱，逐步加入9 mL正己烷淋洗，淋洗液氮吹至0.5 mL后上機測試，得到PAHs洗脫曲線，見圖1（A）。分別取0.5 g魚油、胚芽油、藻油樣品，用3 mL正己烷稀釋混勻加入活化后的MIP-SPE柱，逐步加入9 mL正己烷淋洗，淋洗液吹干后稱重，扣除氮吹管質量為洗脫樣品質量，得到樣品洗脫曲線，見圖1（B）。結合圖1（A和B）可以看出，淋洗溶劑體積6 mL時可去除90%以上的樣本基質且LPAHs損失在5%以內，MPAHs和HPAHs吸附穩定，6 mL正己烷淋洗損失不到1%，故淋洗溶液體積選擇6 mL。

圖1 淋洗溶劑對回收率及凈化效果的影響

2.2 洗脫溶劑的優化

PAHs辛醇-水分配系數較高，難溶于水，易溶于有機溶劑，常用萃取溶劑有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等[17-22]。正己烷洗脫力強，同時易將固相萃取小柱上殘存的脂肪伴隨物洗脫下來，使得非目標化合物干擾增多。乙腈對樣品基質的洗脫具有一定選擇性，但濃縮耗時，易導致LPAHs損失。試驗比較二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮3種溶劑的洗脫效果，詳見圖2（A）。二氯甲烷作為洗脫溶劑效果最佳，15種PAHs的回收率均大于70.0%。進一步優化洗脫溶劑用量，洗脫溶劑用量對回收率的影響見圖2（B）。溶劑用量4 mL時，洗脫不充分，大部分HPAHs回收率偏低。溶劑用量增至8 mL時，15種PAHs的回收率均超過75.0%。進一步增加溶劑用量，MPAHs和HPAHs回收率略有增加，LPAHs回收率降低。這是因為洗脫溶劑體積增加延長氮吹濃縮時間，導致LPAHs損失。因此，選擇8 mL二氯甲烷進行洗脫。

2.3 氮吹條件的優化

氮吹濃縮是前處理過程的最后環節，對苯環數少、分子量小的LPAHs影響尤為明顯[23]。由表1可知，LPAHs蒸汽壓大、沸點低，在濃縮過程中易揮發，導致回收率偏低。文獻報道的單因素試驗研究顯示影響回收率的主要因素有氮氣壓力[24]、水浴溫度[25]、濃縮體積[9]等，綜合最佳濃縮條件有待進一步探究。試驗用二氯甲烷配制質量濃度1.0 μg/L的混合標準溶液，以15種PAHs的平均回收率為指標，氮氣壓力、水浴溫度、濃縮體積為變量，開展三因素四水平正交試驗，因素水平表見表3，試驗設計及結果見表4。根據方差R分析可得，對回收率的影響依次為濃縮體積＞氮氣壓力＞水浴溫度。通過比較K值得到試驗最佳因素組合A2B1C3，按照正交試驗所得最優條件進行3次驗證試驗，測得平均回收率為87.4%，略低于試驗5的回收率87.8%，確定該正交試驗的最優選擇為A2B1C2，即25 ℃水浴加熱，8 psi氮氣壓力氮吹，濃縮至100 μL。

表3 正交試驗因素水平表

表4 正交試驗設計及結果

2.4 色譜條件的優化

15種PAHs包含同分異構體和結構相似物，需優化色譜條件實現目標物的色譜分離。使用常規C18色譜柱進行分析，ACP、FLU等化合物保留時間接近，分離效果不佳。可通過調節梯度洗脫條件實現目標物基線分離，但分析時間過長，不利于檢測工作的開展。試驗選擇Waters PAH C18色譜柱對15種PAHs進行分析，PAH C18柱根據PAHs的結構特點對固定相進行修飾，進而改善峰型，提高目標物分離度，在22 min內實現所有目標物基線分離，ACP與FLU分離度大于1.5，目標物峰型尖銳，對稱性好，檢測分離度和靈敏度得到大幅提高。15種PAHs色譜圖如圖3所示。此外，熒光檢測中激發波長和發射波長的選擇也會影響檢測靈敏度[22]。試驗采用2D單通道模式優化激發和發射波長，得到最佳信號響應，優化后的激發-發射波長見表2。

圖3 色譜圖

2.5 線性范圍與檢出限

在優化條件下，測試1.3.1節配制的混合標準工作溶液。以目標物峰面積（y）對質量濃度（x，μg/L）進行線性擬合。結果表明。15種PAHs在0.2～50 μg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.997。選擇低添加水平樣品，以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，結合樣品前處理過程，得到方法檢出限0.03～0.20 μg/kg、方法定量限0.1～0.6 μg/kg，詳見表5。

表5 化合物的線性方程、相關系數、線性范圍、方法檢出限和方法定量限

2.6 回收率與精密度

采用試驗方法對魚油樣本進行低、中、高三水平加標回收試驗，每個水平重復測定6次，結果見表6。結果表明，在加標濃度范圍內，15種待測物平均回收率為72.3%～98.5%，相對標準偏差（SRSD，n=6）為2.1%～6.1%，方法回收率與精密度良好。

表6 加標回收和精密度實測定結果（n=6）

2.7 實際樣品的測定

利用建立的方法對27份市售功能性油脂樣品進行檢測，分析結果見表7。27份樣本均有不同程度的PAHs檢出，檢出種類包含15種PAHs，檢出率為7.4%～100.0%，檢出水平均值為0.61～7.15 μg/kg。從檢出物質來看，檢出水平最高的是萘，其次是菲和芘，檢出水平最低的是二苯并[a,h]蒽。參考GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》限量標準，檢出苯并[a]芘大于10 μg/kg的樣本1份。參考歐盟（EC）No 835/2011條例規定，檢出苯并[a]芘大于2 μg/kg的樣品4份，PAH4（苯并[a]蒽、?、苯并[b]熒蒽和苯并[a]芘4種PAHs）總量超過10 μg/kg的樣本2份，提示功能性油脂存在一定PAHs污染風險。

表7 實際樣本測定結果

3 結論

建立功能性油脂中15種PAHs的分子印跡固相萃取-高效液相色譜熒光檢測方法。通過優化淋洗、洗脫、濃縮條件，有效提高了LPAHs回收率。15種PAHs回收率在72.3%～98.5%之間，相對標準偏差小于6.1%。相比于國標方法，前處理操作簡單，有機試劑消耗量少，方法檢出限低。各項指標均能滿足日常檢測分析要求，適用于功能性油脂中PAHs的測定。采用試驗方法對27份市售樣本進行篩查，提示我國功能性油脂產品受到不同程度PAHs污染，15種目標PAHs檢出率為100.0%，檢出水平為0.61～7.15 μg/kg，部分產品苯并[a]芘、PAH4值超出參考限值標準，需進一步監測以全面評估其健康風險。