乳腺癌患者外周血中循環腫瘤細胞的檢測及臨床意義

郭毓娟 吳雄 鄭舒靜 陳雅貞

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一，其是發生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，已成為僅次于子宮頸癌的第一大惡性腫瘤，嚴重危害女性患者的生命安全[1]。調查統計顯示，2020 年估計有230 萬新發病例和68.5 萬死亡病例，并呈現出上升的態勢[2]。乳腺癌臨床認為遺傳、乳腺良性疾病未經治療、更年期、過度飲酒等是其誘因，其早期癥狀不明顯，起病隱匿較強，一旦發現通常已屬腫瘤的中晚期，導致治療困難，預后較差[3]。目前，臨床治療乳腺癌有手術，靶向藥物治療，放、化療等方案，雖然可有效提高患者的生存率，但復發和轉移仍是患者死亡的重要原因[4]。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）由澳大利亞籍醫生Ashworth 于1869 年首次提出，其是指進入人體外周血腫瘤細胞的統稱[5]。研究顯示，CTC 在腫瘤的臨床診斷、腫瘤病情轉移、療效評估中發揮著重要的作用，可有效降低患者的病死率[6]。研究報道，早期的乳腺癌患者有20%～30%會出現CTC，并可經過血液擴散至全身，是導致實體瘤遠處轉移的首要條件[7]。在外周血中檢測到CTC 提示腫瘤存在轉移情況發生，有進一步發展為遠處轉移的可能。因此，CTC 在外周血中的含量對乳腺癌的早期發現、治療和預后具有密切的關系。當前，臨床對于分離CTC 多采用密度梯度離心法、免疫磁珠法、微孔濾膜過濾法、雙向電泳法等[8]。本研究采用納米基底富集分離及免疫熒光染色法檢測兩組CTC 檢測陽性率，并就乳腺癌患者外周血中CTC 進行檢測，分析其與臨床病理特征的關系，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取福建省漳州市醫院乳腺外科2020 年12 月—2022年12 月收治的200 例乳腺癌患者納入研究，年齡45 ～60歲，平均（50.22±5.31）歲；全部為女性；其中浸潤性導管癌170 例，浸潤性小葉癌30 例。并選擇同期在福建省漳州市醫院乳腺外科接受手術的40 例良性乳腺病進行對照研究，年齡44 ～59 歲，平均（51.34±5.31）歲；全部為女性；乳腺纖維腺瘤25 例，導管內乳頭狀瘤15 例。兩組基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：（1）患者均經手術病理證實。（2）就診前未接受任何輔助性治療。（3）無其他部位惡性腫瘤病史。（4）本研究患者知情，并簽訂知情同意書。排除標準：（1）哺乳期乳腺癌者。（2）炎性乳腺癌者。（3）合并嚴重心肝腎功能不全者。（4）存在其他惡性腫瘤者。（5）處于急性炎癥過程中者。（6）合并糖尿病等基礎性疾病者。本研究通過福建省漳州市醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

采集患者空腹靜脈血3 ～5 mL，防止穿刺部位污染，前3 mL 不用，給予抗凝處理后在血液室溫15 ～30℃時保存備用。

1.2.2 CTC 檢測納米基底制備

將培養皿放置于等離子儀（廣州善準科技有限公司，型號：VP-R5），用高功率高能氧等離子體轟擊聚苯乙烯基板，制備均勻的納米結構。用3%的APTES 潤洗聚苯乙烯基底，使其覆蓋上正電荷，避光1 h，培養皿放80℃烘箱烘干1 h 備用。

1.2.3 全血處理

采集的靜脈血中注入4 mL 1×的紅細胞裂解液中，室溫放置10 min，然后離心5 min，以3 000 r/min 去除上清，保留細胞。向離心管中加入2 mL 1%磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），然后離心5 min，以3 000 r/min 去除上清。放置于培養皿中，停留50 min。然后向培養皿中加入4%甲醛后置于4℃停留10 min。1 mL 封閉液中注入2 μL 抗泛角蛋白和2 μL 抗-人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her2），2 μL 抗-CD11b 熒光標記一抗，混勻注入培養皿中，4℃孵化一晚。清除抗體，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，注入4 μL 山羊抗-兔 IgG 二抗，使其充分混勻后注入培養皿中室溫孵化1 h。然后再清除抗體，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，隨后加入1 mL 二脒基苯基吲哚（diamino-2-phenyl indole，DAPI），孵化30 min。清除抗體，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，注入DAPI，再用2 mL 磷酸緩沖鹽溶液清洗3 次，然后再注入1 mL 酸緩沖鹽溶液，放置于4℃保存。

1.2.4 免疫組化及熒光原位雜交檢測

使用免疫組化檢測雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR），克隆號分別為SP1、SP2，上海雅吉生物科技有限公司生產。ER、PE 呈黃色、棕黃色顆粒，位于細胞核，采用雙人盲法觀察結果，按照隨機數據計數1 000 個細胞，選擇10 個高倍視野，計算陽性細胞百分比，＜10%確定為（-），≥10%確定為ER、PE（+）。如若結果雙人出現5%的偏差則重新評估。采用（益善生物技術股份有限公司，國械注準20163400777）Her2 基因擴增試劑進行檢查，檢查步驟嚴格按照說明書進行。按照隨機在熒光顯微鏡下選取20 個浸潤性乳腺癌細胞核進行檢查，按照2014 版中國乳腺癌Her2 檢測指南。Her2 陽性標準：Her2/探 針 拷 貝 數CEP17（17p11.1-q11.1）＜2.0 或Her2/CEP17 ≥2.0，平均Her2 拷貝數/細胞≥6，為Her2 陽性。

1.2.5 CTC 的鑒定方法

采用高分辨掃描儀購于（武漢光量科技有限公司，型號：BFI Plus）進行多色成像分析，選擇異硫氰酸熒光素酯（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）、磺基菁5（sulfocyanine 5，CY5）、DAPI 通道。綠色為Her2（+）、藍色為DAPI（+）、橙色為CD11b（+）、紅色為CK（+），當DAPI（+）/CK（+）/CD11b（-）且呈現出完整的細胞形態則表示為CTC。若是DAPI（+）/CK（+）/Her2（+）/CD11b（-）則表示是Her2（+） CTC。操作人員觀察表面熒光顏色，檢測到1 個或以上的CTC 即為陽性。

1.3 觀察指標

比較兩組CTC 檢測陽性率，分析CTC 與年齡、腫瘤大小（T 分期T1、T2、T3）、病理類型（浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌）、血管侵犯、ER 和PR、淋巴結轉移等臨床病理特征相關性，并分析CTC Her2 表達。

1.4 統計學方法

使用SPSS 22.0 統計學軟件分析數據。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗，一致性比較采用Kappa 一致性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CTC 陽性檢測情況比較

200 例 乳 腺 癌 組 織 中，CTC 陽 性130 例， 占 比65.00%；CTC 陰性70 例，占比35.00%；40 例乳腺良性組織未檢測到CTC，兩組比較差異有統計學意義（χ2＝19.765，P＜0.05）。

2.2 乳腺癌患者CTC 與臨床病理特征的關系

乳腺癌患者陽性檢測與血管侵犯有關（P＜0.05）；而與年齡、腫瘤大小、病理類型、ER、PR、淋巴結轉移等均無相關（P＞0.05）。見表1。

表1 乳腺癌患者CTC 與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 乳腺癌患者外周血CTC Her2 陽性檢測率比較

130 例CTC 陽性乳腺癌患者有95 例乳腺癌組織檢測到Her2 陽性。本次結果在外周血檢查出CTC 存在Her2 陽性有80 例，陰性有15 例，經Kappa 一致性檢驗發現，Kappa值為0.812（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌患者外周血CTC Her2 陽性檢測率比較[例（%）]

3 討論

乳腺癌是危害女性身體健康的惡性腫瘤，臨床表現為乳房疼痛、腫塊。研究顯示，我國每年發病率超過50 萬例，并呈逐年增長趨勢[9]。乳腺癌早期缺乏明顯癥狀，確診時大多已發生為中晚期，預后較差。在乳腺癌的發生發展過程中，影響腫瘤細胞生物學行為的因素很多[10]。CTC 是指自發或因診療操作或腫瘤在形成發展中原發病變部位脫落或轉移，從而進入到外周血液循環的腫瘤細胞統稱[11]。CTC 作為液體活檢的一種生物標志物，其具有反映腫瘤負荷，腫瘤轉移病灶的潛力，在臨床實踐中得到了廣泛的應用，是腫瘤轉移過程中重要標志物[12]。研究報道，治療過程中檢測CTC 水平，能夠為治療方案提供一定的參考[13]。但CTC 在血液中含量極其稀少，基因表達不穩定的特點，每10 mL 血液中可能只含有幾個、幾十至上百個CTC，但它有上億個紅細胞與白細胞。因此，尋找有效的檢測方法尤為重要。

研究顯示，納米基底富集分離及免疫熒光原位雜交技術的檢測能夠提高CTC 檢測的敏感性和特異性[14]。本研究結果顯示，200 例乳腺癌組織中，CTC 陽性130 例，占比65.00%；40 例乳腺良性組織未檢測到CTC，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；乳腺癌患者陽性檢測與血管侵犯有關（P＜0.05）；而與年齡、腫瘤大小、病理類型、ER、PR、淋巴結轉移等均無相關（P＞0.05）。分析原因，實體腫瘤的部分腫瘤細胞存在上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）和間充質上皮轉化（mesenchymal epithelial transformation，MET）功能。腫瘤細胞利用原發部位的EMT 作用侵入附近血管，從而在血液中循環。CTC 在血流的剪切力下死亡，只有少數具有高活性和轉移潛力的腫瘤細胞在循環系統中存活[15-16]。本研究結果顯示，乳腺癌患者外周血中CTC 陽性與血管侵犯相關。瘤細胞能夠分泌血管內皮生長因子，從而促使腫瘤生長，腫瘤細胞本身進入血管與血液成分聚合，從而形成癌栓[17]。研究顯示，外周血檢出CTC 能夠預測乳腺癌早期復發轉移，是一種預后的獨立預測因素，可為臨床治療提供依據[18]。并發現治療后CTC 的存在與患者的無進展生存期及總生存期密切相關；CTC 數目越多，表示生存期越短。因此，外周血CTC 檢測能夠動態地觀察乳腺癌患者病情變化，為其轉移和復發的概率做出及時判斷，也可對治療方案提供一定的依據。Her2 作為乳腺癌重要的治療靶點，其表達與乳腺癌的侵襲存在關系，是乳腺癌復發、轉移的重要高危因素之一[19]。本研究結果顯示，130 例CTC 陽性檢查出95 例Her2 陽性。外周血檢查出CTC 存在Her2 陽性有80 例，兩者比較一致性為84.21%（80/95）。與李剛強等[20]結果相一致。由此表明CTC 表面分子標志物可以反映實體腫瘤細胞的生物學特性，檢測CTC 中Her2 能夠為靶向藥物治療提供一定的依據。但有相關研究報道認為，CTC 的Her2 表達在細胞分裂過程中是可變的，在Her2 陰性乳腺癌體內也可檢出Her2 陽性的CTC，Her2陽性的CTC 可能也會分裂出Her2 陰性的CTC[21]。CTC源于腫瘤的一個亞群，存在較高的惡性潛能，其表型與組織存在差異，這可能是部分Her2 陽性患者對抗腫瘤藥物治療效果不佳的原因之一，可能實時監測CTC 中Her2表達對靶向藥治療具有重要的作用。同時，此文的研究結果為乳腺癌患者診治標準制定提供了借鑒內容。

綜上所述，乳腺癌患者外周血CTC 的表達可用于評估其病情，CTC Her2 檢測可能有助實時判斷Her2 的狀態，對乳腺癌患者的預后有一定價值。