硫乙醇酸鹽優化培養基對嗜黏蛋白阿克曼菌生長及代謝產物的影響

武曉玲，徐珒昭，徐遠志，寧 可，解慶剛，許曉曦,*

（1.東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江飛鶴乳業有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 164800）

嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被稱作新一代益生菌，是一種典型的哺乳動物腸道菌，依賴于腸道上皮細胞分泌的黏蛋白生存[1]，是腸道黏液層的關鍵微生物[2]，更與多種疾病存在重要關聯[3]。腸道內Akk降解黏蛋白的代謝產物，如短鏈脂肪酸等，可調節脂質代謝和免疫應答相關基因的表達[4]，減輕肝臟氧化應激和炎癥、減輕乙酰氨基酚誘導的肝損傷[5]。Mithieux等[6]還發現，Akk能促進腸道黏液產生，使黏液層增厚，并通過促進Foxp3＋Treg、白細胞介素IL-10、轉化生長因子TGF-β表達，減少胰島炎癥，在I型糖尿病中起保護作用?？诜嗀kk菌及其外膜蛋白Amuc_1100可增加結腸和腸系膜淋巴結中細胞毒性T淋巴細胞CTL的數量，上調其腫瘤壞死因子TNF-α表達、抑制程序性死亡受體PD-1表達，對小鼠結腸炎相關的結直腸癌起抑制作用[7]。口服Akk還可改善老化小鼠的腸道表型，增強腸屏障完整性和腸細胞增殖再生能力，改善認知功能、減少虛弱和肌肉萎縮，維持健康及延長壽命[8]，因此該菌也被稱為“長壽菌”。除此之外，尚有報道稱Akk在腸黏膜炎[9]、非酒精性脂肪肝[10]、結腸炎[11]等疾病的治療中也發揮重要作用。目前全球唯一一家Akk活菌制劑生產企業——美國Pendulum公司于2020年6月4日已上市銷售，其作為特醫產品主要用于II型糖尿病的治療[6]。

Akk作為一種典型的腸道菌，只能耐受低濃度的氧氣，其體外培養更是生長周期長、生長速度慢。本團隊前期研究發現，該菌生長存在一定的自然周期性，給工業化高密度培養帶來更多難題。到目前為止，Derrine等[12]提出適用于Akk培養的黏蛋白培養基是目前唯一的選擇性培養基，但近年來研究也發現，Akk可在其他培養基中增殖，如腦心浸液肉湯（brain-heart infusion broth，BHI）培養基[13]等。Liu Xinyue等[14]則以黏蛋白培養基為對照，將不同含量的黏蛋白加入BHI培養基中培養，以滿足Akk的營養需求；Machado[15]、Almeidado[16]等用PYG肉湯培養基評估了Akk在不同溫度、大氣和胃腸道模擬條件下的培養情況，活菌數可達到1.3×109CFU/mL，但由于這些培養基成分均較為復雜導致其成本較高，增加了工業化生產的難度。

本團隊研究發現，Akk可利用硫乙醇酸鹽液體培養基，且該培養基成分簡單價格便宜，唯其生長速度較為緩慢。在該培養基的基礎上篩選確定以卵清蛋白代替原培養基中的酵母浸粉，調整培養基中氮源的配比，以磷酸二氫鉀替換氯化鈉，并調整各組分的添加量，篩選出適合工業化生產且價格更低的優化培養基配方。因不同的營養條件可影響菌的代謝產物種類及組成，且目前對Akk代謝產物與宿主疾病間互作關系鮮有報道，目前僅有Martin-Gallausiaux等[17]發現Akk菌培養上清液能夠激活腸上皮細胞中的NF-κB信號通路，上調MUC 2、BIRC 3和TNFAIP 3等腸屏障功能相關基因的表達，提高腸細胞單層的完整性。因此利用非靶向代謝組學技術對比分析Akk在這兩種培養基中代謝產物的差異，結合京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路探究其特征性代謝產物與疾病的關聯，并以此證明優化培養基在工業化高密度培養中的優勢及應用前景，旨在為Akk在中國的工業化生產提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AkkDSM 22959 北京北納創聯生物技術研究院；硫乙醇酸鹽液體培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；無水葡萄糖 天津市凱通化學試劑有限公司；卵清蛋白（80%～90%） 大連美侖生物技術有限公司；酪蛋白胨 上海麥克林生化科技有限公司；硫代乙醇酸鈉 中國惠興生化試劑有限公司；L-胱氨酸 上海瑞永生物科技有限公司；刃天青 北京博奧拓科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純） 天津致遠化學試劑有限公司；氫氧化鈉 天津市大陸化學試劑廠；1499230-935乙腈（分析純）、70221乙酸銨（≥98%） 德國默克公司。

1.2 儀器與設備

GI 54 DWS高壓滅菌器 美國致微儀器有限公司；OptiClean 1300潔凈工作臺 上海力康精密科技有限公司；LC-85 C隔膜式抽氣泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；TS 2210 K 12 GB 5099氮氣鋼瓶 哈爾濱市通達工業氣體有限公司；SPL-80生化培養箱 天津萊玻特瑞儀器設備有限公司；UV 752 N紫外分光光度儀 上海儀電分析儀器有限公司；5430 R低溫高速離心機 德國艾本德公司；AB Triple TOF 6600質譜儀 美國愛博才思公司；1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與傳代

將安瓿管中的200 μgAkk凍干菌粉接入10 mL硫乙醇酸鹽液體培養基中，在37 ℃條件下厭氧（101 kPa、90% N2、10% CO2）培養5 d，菌種恢復活力后，以4%[18]（體積分數）接種量接種至硫乙醇酸鹽液體培養基中傳代，在上述條件下培養，每隔24 h進行傳代，實驗使用第3代菌。所有操作均在無菌條件下進行。

1.3.2Akk在兩種培養基中生長曲線的測定

將活化后第3代Akk按照4%接種量分別接種至硫乙醇酸鹽液體培養基和優化培養基中，在1.3.1節條件下培養。測定菌液密度，每隔4 h測定一次菌液的OD600nm，以培養時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制生長曲線，每次測定均設置3 個重復。

1.3.3 活菌計數

采用平板傾注的方法進行平板計數。用生理鹽水將Akk在兩種培養基中生長到穩定期的菌液進行梯度稀釋，實驗選用10-5、10-6、10-73 個梯度，分別吸取200 μL稀釋后的菌液到滅菌培養皿中，配好的瓊脂培養基冷卻到45 ℃左右，傾注到培養皿中，并立即輕輕水平轉動培養皿，使菌液于培養基充分混勻，待培養基凝固后將平板倒置，在1.3.1節條件下培養，4 d后選取菌落數在30～300 個之間的平板統計菌落數，按下式計算活菌數：

活菌數/（CFU/mL）=同一稀釋度平板上菌落平均數×稀釋倍數×5

1.3.4Akk發酵上清液的制備

將Akk分別接種到硫乙醇酸鹽液體培養基和優化培養基中，在1.3.1 節條件下培養至穩定期，1 000 r/min、4 ℃離心10 min，并用0.22 μm濾膜過濾，得到發酵上清液，于-80 ℃冰箱內保存備用，每個樣本設置6 次重復。

1.3.5Akk發酵液樣本提取

樣本在4 ℃環境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預冷甲醇-乙腈-水（2∶2∶1，V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液真空干燥，質譜分析時加入100 μL乙腈溶液（乙腈∶水=1∶1，V/V）復溶，渦旋，14 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液進樣分析。

1.3.6 液相色譜-質譜分析

1.3.6.1 色譜條件

樣本采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統HILIC色譜柱進行分離；柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量2 μL；流動相A為水＋25 mmol/L乙酸銨＋25 mmol/L氨水，B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7 min，5%～35% A、95%～65% B；7～8 min，35%～60% A、65%～40% B；8～9 min，60% A、40% B；9～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12 min，5% A、95% B；整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續分析。樣本隊列中插入質控（quality control，QC）樣品，用于監測和評價系統的穩定性及實驗數據的可靠性（QC樣本是由待測樣本等量混合制成，在待測樣本液相色譜-串聯質譜進樣前、進樣中和進樣后上機檢測）。

1.3.6.2 質譜條件

采用AB Triple TOF 6600質譜儀進行樣本一級、二級譜圖的采集。色譜分離后的電噴霧電離源條件如下：霧化氣壓（Gas1）60 kV，輔助氣壓（Gas2）60 kV，簾氣壓力30 arb，發射源溫度600 ℃，噴霧電壓±5 500 V（正負兩種模式）；飛行時間質譜掃描范圍m/z60～1 000，產物離子掃描范圍m/z25～1 000，飛行時間質譜掃描累積時間0.20 s/spectra，產物離子掃描累積時間0.05 s/spectra；二級質譜采用數據相關采集獲得，并且采用高靈敏度模式，去簇電壓設為±60 V（正負兩種模式），碰撞電壓設為（35±15）eV。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 Akk在兩種培養基中的生長情況對比

由于Akk在硫乙醇酸鹽液體培養基中生長其菌液密度極低（生長速度慢且活菌數較少），因此本課題組前期在硫乙醇酸鹽液體培養基的基礎上，對Akk培養基進行優化。為確定Akk在兩種培養基中的生長穩定期以制備發酵上清液樣本，并對比Akk在兩種培養基中的生長情況，通過測定菌液OD600nm并繪制生長曲線，結果如圖1所示。

圖1 Akk在兩種培養基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of Akk in original and optimized thioglycolate medium

由圖1可知，0～8 h為Akk的生長遲緩期，12 h左右進入生長對數期。在硫乙醇酸鹽液體培養基中，Akk生長對數期為12～32 h，32 h菌液OD600nm達到最高（0.269±0.003），之后進入穩定期，穩定期活菌數為6.75×107CFU/mL。而在優化培養基中的生長對數期同樣在12 h左右進入對數期，44 h時菌液OD600nm最高可達0.761±0.011，是硫乙醇酸鹽液體培養基的2.83 倍，并在44 h之后趨于穩定，穩定期的活菌數為1.74×109CFU/mL，比硫乙醇酸鹽液體培養基高出2 個數量級。由此可知，優化后的培養基雖相對延長了Akk的對數生長期，但顯著提高了Akk的菌液密度及活菌數。并由此選擇其在硫乙醇酸鹽液體培養基和優化培養基中進入生長旺盛期的32 h和44 h發酵上清液，用以分析兩組樣本的差異代謝物。

2.2 差異性代謝組學分析結果

2.2.1 QC分析

為評價儀器的穩定性及數據質量的可靠性，分別在正負離子模式下將QC樣本總離子流圖進行譜圖重疊比較，結果如圖2所示。結果表明兩種模式下各色譜峰的響應強度和保留時間均基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小，實驗結果較為可靠。

2.2.2 代謝物鑒定數量及化學分類歸屬統計

通過高效液相色譜-串聯飛行時間質譜聯用儀檢測Akk在兩種培養基發酵上清液中的代謝產物，正負離子模式下合計鑒定到代謝產物2 253 種，其中正離子模式下鑒定到代謝產物1 585 種，負離子模式下鑒定到668 種。根據化學分類歸屬信息將所有代謝物進行分類統計，各類代謝物數量所占比例如圖3所示。

圖3 鑒定的代謝物在各化學分類的數量占比Fig.3 Proportion of metabolites identified in various chemical classifications

兩組樣本中檢測到的代謝物包括有機酸及其衍生物（34.976%），脂質和脂質類分子（21.127%），有機雜環化合物（10.567%），苯甲酸類（6.569%），有機氧化合物（5.237%），苯丙烷和聚酮（4.172%），核苷、核苷酸和類似物（2.308%），有機氮化合物（1.243%），生物堿及其衍生物（0.666%），木質素、新木質素及相關化合物（0.178%），有機金屬化合物（0.133%），有機硫化合物（0.133%），烴類衍生物（0.089%）和未命名化合物（12.605%）等。

2.2.3 組間差異分析

本研究結合單變量統計分析和多維統計分析方法，篩選Akk在兩種培養基中的顯著性差異代謝物，對正、負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物進行分析。

2.2.3.1 單變量統計分析

在進行兩組樣本間的差異分析時，常用的單變量統計分析方法包括差異倍數（fold change，FC）分析、T檢驗/非參檢驗?；趩巫兞糠治觯瑢φ?、負離子模式下檢測到的所有代謝物（含未被鑒定的代謝物）進行差異分析，篩選出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差異代謝物共902 種，其中正離子模式下670 種，負離子模式下232 種。將這些差異代謝物用火山圖的形式表示，結果如圖4所示。

圖4 正（a）、負（b）正負離子模式火山圖Fig.4 Volcano maps of differential metabolites in positive (a) and negative (b) ion modes

如圖4 所示，每個圓圈代表一個特定的代謝產物，優化后相對優化前，紅色為顯著上調的代謝產物（FC＞1.5，P＜0.05），藍色為顯著下調的代謝產物（FC＜0.67，P＜0.05），圓圈越靠近左右兩邊和上邊，差異性越顯著，黑色為非顯著性差異代謝物。之后研究均針對紅色和藍色圓圈代表的顯著性差異代謝物。

2.2.3.2 多維統計分析

多維統計分析可以從總體水平反映組間差異以及組內的變異度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。將鑒定到的所有代謝物重新線性組合得到PCA模型，采用PCA方法，能從總體上反映樣本的總體分布趨勢和組件樣本的差異度。兩組樣本的PCA得分圖如圖5所示。

圖5 正（a）、負（b）離子模式下PCA得分圖Fig.5 PCA score plots in positive (a) and negative (b) ion modes

圖5中橢圓代表95%置信區間，同一顏色的點表示組內的各個生物學重復，由點的分布狀態可以看出，該模型可以區分兩組樣本，組間樣本的數據點很好地集中在一起。PCA模型參數R2X越接近1表明模型越可靠，正、負離子模式下的模型解釋率R2X分別為0.835和0.855。結果表明該模型穩定可靠，實驗重復性好，隨機誤差較小，可進一步對樣本進行差異性分析。

OPLS-DA是為了濾除與分類信息無關的噪音、提高模型的解析能力和有效性。為避免模型在建模過程中發生過擬合，保證模型的有效性，采用置換檢驗對模型進行檢驗。OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗如圖6所示。

圖6 正（a）、負（b）離子模式下OPLS-DA得分圖及置換檢驗圖Fig.6 OPLS-DA score plots and permutation test plots in positive (a) and negative (b) ion modes

如圖6所示，t[1]能最大程度反映組間差異，而to[1]則反映組內變異?？梢钥闯鯫PLS-DA模型可顯著區分兩組樣本，且組內差異較小，結果與PCA模型一致。經7 次循環交互驗證得到模型評價參數R2Y、Q2，通常情況下Q2＞0.5 即表明模型穩定可靠。該模型正、負離子模式下的Q2分別為0.998、0.999，均大于0.5。在置換檢驗中，隨著置換保留度逐漸下降，隨機模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現象，模型穩定性良好。

2.2.3.3 篩選差異代謝物

O P L S-D A 模型得到的變量權重值（v a r i a b l e importance for the projection，VIP）表示變量投影重要度，值越大，表示越重要。本實驗以VIP＞1和P＜0.05為顯著性差異代謝物的篩選標準，正離子模式下篩選到670 種顯著性差異代謝物，負離子模式下篩選到232 種顯著性差異代謝物，由于篩選到的差異代謝物過多，且表格無法直觀地顯示這些代謝物的FC，因此，選擇VIP值前50的差異代謝物，以柱狀圖形式展示鑒定到的顯著性差異代謝物的FC變化，結果如圖7所示。可以看出，與硫乙醇酸鹽液體培養基相比，Akk在優化培養基中發酵后，正離子模式下22 種代謝產物顯著上調，28 種代謝產物顯著下調，負離子模式下顯著上調代謝產物22 種，顯著下調代謝產物28 種。后續將對這些顯著性差異代謝產物進行分析。

圖7 正（a）、負（b）離子模式顯著性差異代謝物表達FC分析（VIP前50）Fig.7 Fold change (FC) of significantly differential metabolites with top 50 highest VIP scores in positive (a) and negative (b) ion modes

2.2.4 聚類分析

為了更全面直觀地顯示樣本之間的關系以及代謝物在不同樣本中的表達模式差異，將VIP值前50的顯著性差異代謝物用層次聚類進行聚類分析，結果如圖8所示。聚在同一簇內的代謝物具有相似的表達模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或者細胞通路。

Akk發酵優化培養基產生的代謝產物中，顯著上調的代謝產物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、煙曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、檸檬酸鹽、甘露糖和各種多肽等，這些代謝產物在人體疾病的調控中發揮著重要作用。其中肌酸[19]被認為有抗炎作用，可減少炎癥標志物的出現，并可抑制免疫反應，并在鈣穩態中發揮作用，可減少氧化應激，且有可能在水腫、神經炎癥和神經傳遞改變方面發揮作用；煙曲霉素[20]是一種具有多種生物活性的抗生素，與降低體質量、有效抑制肝腫瘤的生長和轉移功能相關，Takayuki等[21]還發現，煙曲霉素是一種有效的血管生成抑制劑，能通過激活內皮細胞中的p53通路上調p21表達，抑制血管生成并抑制腫瘤細胞生長。巴多昔芬[22]是一種雌激素受體調節劑，已被美國食品和藥物管理局批準上市，用于預防絕經后女性骨質疏松。近年來大量研究證明了巴多昔芬在疾病中的作用，如抑制雌激素受體Cyclin D 1、p-P 70 S 6 K、Survivin、c-Myc和Bcl-2的表達抑制雌激素受體陽性乳腺癌細胞[23]；通過抑制IL-6/IL-6R/STAT3信號傳導發揮抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，并能夠在腫瘤細胞中抑制白細胞介素IL-6與gp 130蛋白結合并阻斷其下游信號通路轉導[24]；可有效穿過血腦屏障，緩解卵巢切除誘導的小鼠空間記憶損傷等[25]。由此表明，Akk的這些代謝產物是該菌在緩解腸道炎癥，治療癌癥、神經系統等疾病主要功能因素。

顯著下調的產物有：烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、煙酰胺、高三尖杉酯堿、靈芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龍膽苦苷等。其中，烏頭堿是有毒植物中存在的一種毒性成分—二萜類生物堿，毒性極強，具有心臟毒性、神經毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同時能通過血液吸收危害肝臟、腎臟等靶器官[26]。實驗結果發現優化培養基中的烏頭堿顯著下調，說明Akk在優化培養基中發酵能更大程度發揮預防及治療心血管疾病、神經系統疾病、肝臟疾病的作用[27]。除此之外的Akk代謝產物均被發現有一定抗炎、抗腫瘤、抗肥胖等益生功效，但是優化培養基中這些產物均有不同程度的下調，因此表明，補充Akk活菌制劑時應注意其有效菌數，過多的活菌數可能帶來疾病風險，Wang Qi等[28]研究發現，硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）緩解還是惡化骨關節炎（osteoarthritis，OA）與腸道菌群的結構有關，在Akk豐度適中時，CS能夠改善OA，但Akk含量高于或者低于硫酸酯酶分泌菌和硫酸鹽還原菌時，CS均能加重OA。也有研究[29]提出，補充滅活Akk可顯著改善超重/肥胖的胰島素抵抗者的多項代謝指標，且安全性良好，效果優于Akk活菌，由此為其作為后生元提供了有效證據。

2.2.5 KEGG通路注釋與分析

在生物體內不同代謝物需要相互協調行使其生物學功能，基于KEGG通路分析有助于更進一步了解其生物學功能。為了解Akk在不同培養基中代謝產物含量變化的機制，將正負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物整合后進行KEGG通路注釋，并根據P值選擇顯著性最高的前20 條KEGG通路進行富集，富集結果以氣泡圖的形式顯示，結果如圖9所示。

圖9 KEGG富集通路氣泡圖Fig.9 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway

富集最顯著的5 個通路為蛋白質的消化和吸收、氨?；鵷RNA生物合成、膽汁分泌、ABC轉運蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白質的消化和吸收通路富集最為顯著，強調蛋白質是Akk的第一營養需求，因此培養基優化主要針對這一需求進行。在這些通路中，蛋白質的消化和吸收、膽汁的分泌是Akk消化系統中的代謝通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遺傳信息處理中發揮重要作用，ABC轉運蛋白涉及到Akk的膜運輸功能，對外界環境的信息進行處理，氨基酸生物合成則可合成多種氨基酸。除膽汁分泌通路外，其余4 種代謝通路均富集到了多種氨基酸，人體所需的多種必需氨基酸包含其中，這些氨基酸均由培養基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代謝得到。富集到膽汁分泌通路上的代謝物有20 種，這些代謝物包括茚地那韋、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韋、烏本苷、長春花堿等，其中茚地那韋[30]是一種選擇性、強效和特異性的HIV蛋白酶抑制劑，目前用于治療獲得性免疫缺陷綜合征，還能顯著減輕鏈脲佐菌素誘導的阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）相關的記憶缺陷[31]，而相關研究表明，AD大鼠模型中，Akk可減輕AD大鼠的認知障礙[32]。依托泊苷[33]、多烯紫杉醇[34]、長春花堿[35]等均為有效的抗腫瘤和抗癌藥物，可應用于相應的癌癥治療。此外一些研究也證實了Akk在肺癌[36]、結直腸癌[12]、非小細胞肺癌[37]等的治療中發揮了重要作用。因此表明，其膽汁分泌通路可能是Akk發揮其功效的重要通路之一。蛋白質的消化和吸收通路中富集到了一種短鏈脂肪酸——丙酸，它除能維持腸道健康、緩解腸道炎癥外，在人體其他組織和器官中也可發揮重要作用，膳食中補充丙酸可通過抑制食欲提高胰島素敏感性，并增加能量消耗防止高脂飲食引起的肥胖[38]。據報道[9]，Akk在體外培養時主要代謝產物為丁酸和丙酸，而在優化培養基發酵后丙酸呈現顯著上調，一方面說明該培養基更有利于Akk發揮改善腸道疾病、減肥等作用。但目前也有報道，機體內有機酸累積與類風濕性關節炎有關[39]。由此也表明，腸道中Akk活菌數量應保持一定上限，否則會帶來不良健康影響。

Akk發酵優化培養基通過影響其代謝通路，這些代謝通路產生代謝產物較硫乙醇酸鹽液體培養基顯著上調，一方面表明該培養基組分能使Akk更好地發揮抗腫瘤、調節機體免疫、緩解腸道炎癥等益生功能，另一方面，顯著下調的代謝產物則從側面說明如果腸道內Akk豐度過高可能帶來某些疾病風險，如增加骨關節炎及類風濕性關節炎等患病風險等，且如果人體本身患有腸道炎癥補充Akk活菌反而會加重病情。

3 結 論

目前已知Akk與人體某些疾病存在重要關聯，但至今為止將其工業化高密度培養依然存在技術難題。本研究對硫乙醇酸鹽培養基進行了優化，篩選出了適合工業化生產的培養基配方，并通過非靶向代謝組學技術比較分析了Akk發酵優化培養基和硫乙醇酸鹽液體培養基產生的代謝產物之間的差異，這些代謝產物與Akk發揮抗炎、抗癌、調節腸-腦軸和腸-肝軸等功能密切相關；將這些差異性代謝物進行KEGG通路富集，發現Akk的蛋白質消化和吸收通路富集最為顯著，證明了影響該菌生長的最重要因素是蛋白質，同時也表明以此對培養基進行優化的合理性。為該培養基在工業化生產中應用提供了依據，也為將來Akk高密度培養以及作為后生元的可能性提供了研究和應用基礎。