濃香型白酒窖底泥和窖壁泥細菌群落結構差異性分析

曾 波，鄒永芳，饒家權，王曉平，文 靜，黃治國,3,*

（1.四川輕化工大學 釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業股份有限公司，四川 射洪 629000；3.中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000）

土壤微生物在生態系統物質循環和能量流動中不可或缺，并且通過參與固氮、氨化、硝化和反硝化等重要生態過程，調控土壤的結構以及理化性質[1-2]。黑土帶因其土壤有機質含量高和耕地肥沃被稱為我國糧食生產的“壓艙石”和“穩壓器”[3]。窖泥作為微生物的載體，為釀酒微生物發酵過程中提供適宜的生存環境，而微生物種群在窖池內的復雜物質能量代謝，為白酒生產提供源源不斷的動力，因此窖泥被稱為釀酒“微生物黃金”[4]。四川具有“川酒甲天下”的美譽，以其獨特的濃香型白酒聞名世界，長期以來，泥窖被用作為發酵濃香型白酒的反應器，窖泥在長期發酵過程中形成了復雜的生態系統，構建了特殊的微生態結構[5]。關于微生物空間分布的研究重點已經轉為環境因子和歷史進化因素驅動土壤微生物空間分布的機制上。近年，隨著高通量測序技術的發展和微生物組學的應用，對窖泥中的微生物群落結構有更系統的認識。已有研究表明，窖泥微生物是白酒風味物質形成的主要功能微生物來源之一，優質窖泥發酵生產的白酒更好[6]。Chai Lijuan等[7]針對不同窖齡窖泥的微生物群落結構和代謝產物物的變化規律，提出了窖泥微生物群落的定向進化模式，并提供了一種加速窖泥微生物富集的替代方法。吳浪濤等[8]研究不同發酵時期的窖泥，證明了窖泥理化指標、關鍵風味物質和窖泥功能微生物有直接或間接的關系。Zheng Yan等[9]研究窖泥原核生物群落的變化以及相互作用，發現微生物之間的協同作用有助于提高窖泥的質量。目前，關于窖泥研究多基于微生物群落結構解析，而關于導致窖泥細菌群落差異的環境因子及與其相關的功能菌相對較少。

本研究以四川濃香型酒廠正常窖池（窖齡30 a以上）的窖底和窖壁泥作為樣品，測定了窖泥樣品6 個理化指標，并借助高通量測序技術分析窖泥中細菌群落結構，比較窖底、窖壁泥理化指標與細菌群落的差異性，解析理化指標與關鍵菌屬的相關性以及參與酸代謝的酶類差異。旨在為進一步探究窖泥中細菌群落在環境壓力下參與調節的機制、窖泥功能菌篩選和窖泥護養提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自四川某濃香型白酒廠窖池的窖底泥和窖壁泥。采用五點取樣法，以窖底和窖壁為平面，在窖底確定對角線的中點作為中心抽樣點，再在對角線上選擇4 個與中心樣點距離相等的點作為樣點，如圖1所示，每個樣點取樣100 g，將其混合作為窖底泥樣（500 g），窖底泥樣品用D表示，取五口不同的窖池，標號為D1、D2、D3、D4、D5；窖壁也按此方法取樣，窖壁泥樣品用B表示，取五口不同的窖池，標號為B1、B2、B3、B4、B5。將窖泥樣品取出混勻后分成2 份裝入無菌袋并冷藏，快速送回實驗室，貯存在4 ℃冰箱和-80 ℃冰箱，分別用于檢測理化指標和窖泥DNA的提取。

圖1 窖泥取樣位置Fig.1 Sampling locations of pit mud

E.Z.N.A.?soil試劑盒 上海晶諾生物科技有限公司；氯化鈉、碘化汞、碘化鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、氯化銨、硫酸亞鐵銨、濃硫酸、重鉻酸鉀、鄰菲啰啉、氟化銨、鹽酸、鉬酸銨、磷酸二氫鉀、氯化亞錫（均為分析純） 成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2400紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、電泳儀 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機 德國H e t t i c h 公司；油浴鍋 奧斯豪儀器有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥理化指標檢測

pH值、過氧化氫酶活性用新鮮的窖泥測定，銨態氮在風干過程中易變化，也需用新鮮的泥樣測定；將窖泥攤平在鐵盤中自然風干，風干后研磨成粉末，保存在干燥器中，用于測定有效磷、腐殖質。

pH值：參照《釀酒分析與檢測》[10]，將樣品用飽和氯化鈉提取后，pH計測定；銨態氮含量：納氏試劑比色法測定[11]；有效磷含量：氟化銨-鹽酸比色法測定[12]；腐殖質含量：油浴法測定[13]；過氧化氫酶含量：容量法測定[14]。

1.3.2 窖泥總DNA的提取

根據E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進行總DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，同時利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。

1.3.3 PCR擴增

用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3～V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。全部樣本按照正式實驗條件進行，每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物送到上海美吉生物技術有限公司進行測序，用于后續分析。

1.3.4 real-time PCR法檢測樣本中16S基因的絕對含量

使用16S rDNA通用引物341F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-TTA CCG CGG CTG CTG GC-3’）擴增窖泥宏基因組DNA，得到16S rDNA混合擴增產物。具體步驟參照張會敏等[15]方法。

1.4 數據處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接。使用UPARSE軟件根據97%相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123）。利用R語言和Origin 2018軟件作圖。理化數據采用±s表示，窖泥理化的差異顯著性分析通過軟件SPSS實現。

2 結果與分析

2.1 窖泥樣品理化指標

由圖2可知，窖壁泥銨態氮含量顯著高于窖底泥（P＜0.05）；窖底泥的pH值、過氧化氫酶活性顯著高于窖壁泥（P＜0.05），銨態氮可以作為氮源促進窖泥細菌的代謝；窖底泥和窖壁泥的有效磷含量、腐殖質含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 窖底泥和窖壁泥的理化指標Fig.2 Physicochemical indicators in bottom and wall pit mud

2.2 窖泥細菌群落的α多樣性分析

如表1所示，所有樣品序列數超過40 000 條，窖底和窖壁泥的序列數無顯著差異，從窖泥樣品物種豐富度（Shannon指數、Simpson指數）可以看出，窖壁泥中的微生物群落更豐富，多樣性更高；由圖3可知，窖壁泥的OTU種類高于窖底泥，更加證明了窖壁泥的微生物多樣性更高，窖底、窖壁泥的細菌群落結構受到不同理化指標的影響，而這些理化指標是哪些，還需要進一步分析研究。圖4為通過絕對定量檢測出的窖泥樣本中16S rDNA豐度，窖底泥16S rDNA拷貝數略高于窖壁泥，但都在相同數量級上，本研究老窖泥中16S rDNA拷貝數與已有研究規律一致[16]。

表1 窖底、窖壁泥細菌群落α多樣性指數Table 1 α-Diversity index of bacterial communities in bottom and wall pit mud

圖3 窖底泥和窖壁泥OTU水平Venn圖Fig.3 Venn diagram showing the number of shared and unique OTUs between bottom and wall pit mud

圖4 兩組窖泥樣本中16S rDNA拷貝數Fig.4 Number of 16S rDNA copies in two pit mud samples

2.3 窖泥細菌群落的β多樣性分析

將細菌群落與窖底窖壁泥樣品進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），見圖5，提取到的PC1和PC2特征值分別是1.448和0.211，且累計方差占83.29%，說明成分劃分合理。按照PC1和PC2的劃分，窖底泥D1、D2、D3、D4、D5在同一區域，且較集中。窖壁泥B1、B2、B3、B4、B5分布離散，窖底和窖壁泥的在PCoA圖中分布與微生物門和屬水平相對豐度圖的分析結果相對應，結果表明窖底泥相比窖壁泥，細菌群落結構組成相似度更高。按照PC1和PC2劃分出的窖泥樣品具有一定的科學性。

圖5 細菌群落多樣性PCoA圖Fig.5 PCoA plot of bacterial community diversity

將窖泥序列進行OTU物種注釋，得到排名前7的門以及排名前20的屬，others表示排名靠后的門和屬。由圖6a可知，窖底和窖壁泥的細菌群落中，占主導地位的都是厚壁菌門（Firmicutes），其中窖底泥樣品Firmicutes占79.52%～88.87%，窖壁泥樣品Firmicutes占66.65%～90.69%，細胞壁由一層較厚的含胞壁酸的肽聚糖構成，很多厚壁菌可以產生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環境。擬桿菌門（Bacteroidetes）在窖底泥中占6.15%～12.14%，在窖壁泥中占0.35%～18.56%；互養菌門（Synergistetes）在窖底泥中占1.25%～7.03%，在窖壁泥中占1.77%～31.63%；變形菌門（Proteobacteria）在窖底泥中占0.2 8%～1.8 8%，在窖壁泥中占0.06%～0.43%，Proteobacteria包括很多可以進行固氮的細菌，大多數營兼性或者專性厭氧及異養生活；放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chlorflexi）、窖底窖壁泥中的占比較少，基本一致。由圖6b所示，窖底泥和窖壁泥在屬水平上的優勢菌屬存在差異，窖底泥的優勢菌屬為氫孢菌屬（Hydrogenispora）、產己酸菌屬（C a p ro i c i p ro d u c e n s）、胺桿菌屬（Aminobacter ium）、Proteiniphilum等，窖壁泥的優勢菌屬為C a p ro i c i p ro d u c e n s、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乙酸互營菌屬（Syntrophaceticus）、Aminobacterium、Proteiniphilum、Petrimonas、沉積菌屬（Sedimentibacter）等。

圖6 細菌群落在門水平（a）和屬水平（b）的相對豐度Fig.6 Relative abundance of bacterial community at the phylum (a) and genus (b) levels

2.4 窖底窖壁泥的細菌群落物種差異

利用組間差異檢驗方法，根據得到的群落豐度數據，運用嚴格的統計學方法，對兩組窖泥細菌群落進行假設檢驗，評估物種豐度差異的顯著性水平，獲得具有顯著差異的物種信息。通過物種差異分析揭示窖底和窖壁泥在屬水平上具有顯著差異的細菌類群，圖7結果表明窖底泥中Hydrogenispora相對豐度顯著高于窖壁泥（P＜0.001），Caproiciproducens（P＜0.01）、Lactobacillus（P＜0.01）、Syntrophaceticus（P＜0.05）相對豐度顯著低于窖壁泥。理化指標對窖底和窖壁泥中具有顯著差異的細菌群有重要影響，對白酒風味物質的產生具有可能具有促進作用。

圖7 物種差異兩組比較圖Fig.7 Comparison of bacterial species differences between bottom and wall pit mud

2.5 理化指標與細菌群落結構相關性

如圖8所示，對于窖底泥（D1、D2、D3、D4、D5）的細菌群落結構，pH值對其有較強的影響力，其次是有效磷含量；對于窖壁泥B4、B5的微生物群落結構，腐殖質對其有較強的影響力，且腐殖質與過氧化氫酶對細菌群落結構的影響較為相似，其次是銨態氮、有效磷、過氧化氫酶；對于窖壁泥B1、B2的細菌群落結構，銨態氮對其有較強的影響力。結果發現Hydrogenispora與pH值有很強的正相關，一些產酸細菌與pH值有很強的負相關；Lactobacillus與過氧化氫酶含量有較強的正相關，Petrimonas、Proteiniphilum與有效磷、腐殖質、過氧化氫酶呈正相關；Aminobacterium與銨態氮呈正相關。冗余分析（redundancy analysis，RDA）結果證實了pH值與窖底泥細菌群落結構較強的相關性，銨態氮含量、腐殖質含量、過氧化氫酶活性對窖壁泥細菌群落結構具有一定的相關性。

圖8 理化指標與細菌群落結構相關性RDA圖（屬水平）Fig.8 RDA plot of correlation between physicochemical indicators and bacterial community at the genus level

由圖9可知，pH值與Ruminofilibacter、Haloplasma等9 個菌屬呈顯著正相關，與L a c t o b a c i l l u s、Caloribacterium、Atopobium等8 個菌屬呈顯著負相關；腐殖質含量與Lactobacillus、Syntrophomonas、Tissierella3 個菌屬呈顯著正相關。銨態氮含量、有效磷含量、過氧化氫酶含量其他指標不同，與豐度前30的菌屬沒有顯著的相關性。從圖9可以直觀看出pH值與屬水平總豐度前30物種當中的17 個菌屬具有顯著相關性，因此該環境因子對細菌群落的影響最大，與RDA中pH值對窖底泥的影響程度最大結果一致。

圖9 理化指標與菌群相關性熱圖Fig.9 Heatmap of correlation between physicochemical indicators and bacterial flora

2.6 參與酸代謝的功能酶分析

通過PICRUSt2標記基因序列預測窖壁和窖底泥相關酶功能和豐度信息，結合參與酸代謝的相關酶，利用氣泡圖表示窖壁泥和窖底泥酶相關豐度的差異，如圖10所示，窖壁泥中參與酸代謝的酶類相對豐度顯著高于窖底泥，在厭氧環境下，丙酮酸被L-乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27）氧化為乳酸；在丙酮酸激酶（EC 2.7.1.40）的作用下轉化為乙醇。窖壁泥中多種酶還參與乙酰輔酶A合成，這是酸代謝途徑的關鍵環節，有助于濃香型白酒香味物質的生成。結果表明，窖壁泥的細菌群落具有產香的巨大潛力。

圖10 酸代謝途徑（a）和酶相對豐度氣泡圖（b）Fig.10 Acid metabolism pathway (a) and bubble chart of relative abundance of enzymes (b)

3 討 論

本研究比較了窖泥的5 項理化指標和窖底、窖壁泥的細菌群落結構，發現了窖底泥和窖壁泥的理化指標差異和細菌群落結構分布特點。窖泥中占主導地位的優勢菌門是Firmicutes，平均含量達到78%，其他2 個優勢菌門為Bacteroidetes、Synergistetes，窖泥的優勢菌屬為Caproiciproducens、Lactobacillus、Syntrophaceticus和Hydrogenispora等20 個菌屬，張明珠等[17]研究老窖泥中的優勢菌門與本實驗結果一致，綜合理化指標分析，這也說明本研究樣品符合老窖泥的特征。窖壁泥和窖底泥的細菌群落在屬水平上具有顯著差異，窖底泥的優勢菌屬Hydrogenispora，其相對豐度顯著高于窖壁泥，窖壁泥的優勢菌屬Caproiciproducens、Lactobacillus、Syntrophaceticus，其相對豐度顯著高于窖底泥。Lactobacillus含量與窖泥質量呈一定的負相關[18]，窖底泥中該菌的含量較低，可能是窖泥老熟過程中，窖底泥的菌群已經成熟，代謝功能比較完善，而Lactobacillus能夠產乳酸，窖泥中乳酸是含量最大的有機酸，窖泥pH值的升高與其中乳酸降解有關[19]，而pH值與窖泥質量直接相關[20]，進一步了解Lactobacillus在窖泥中分布差異的原因，有益于提升窖泥的品質。平行樣品之間窖底泥細菌群落結構更具均一性，窖壁泥細菌群落結構有一定差異性，這也是進行窖泥樣品細菌群落的PCoA時窖壁泥樣品點分布離散和窖底泥樣品點分布集中的原因。自然環境的復雜性和大多數生境中存在的大量生態位常被用來解釋在存在競爭排斥情況下微生物多樣性的維持，長久的環境壓力將為頂級群落演化提供動力[21]。窖池底部窖泥長期處于厭氧和高酸環境，所以演化結果讓細菌群落結構的組成相似度更高，窖底窖泥微生物的代謝功能更加完善。

窖壁泥中參與酸代謝的酶類相對豐度顯著高于窖底泥，并且具有相對豐度顯著高于窖底泥的產酸細菌，比如Caproiciproducens、Lactobacillus、Syntrophaceticus等，推測窖壁泥富集的多種細菌群落，具有產生參與酸代謝酶類的特性[22]，這些產酸細菌具有以乙醇或乳酸為底物合成丁酸己酸的潛力[23]，能為白酒釀造代謝豐富的風味物質，例如乙酸、丁酸、己酸等[22]。Lactobacillus在發酵過程中將糖類分解成乳酸，具有較強的代謝碳水化合物的產酸能力，乳酸可作為合成其他脂肪酸的底物，同時可以與乙醇通過酯化反應生成濃香型白酒獨特風味的乳酸乙酯；Caproiciproducens是窖壁泥中的優勢菌屬，該類菌具有利用果糖、乳酸、半乳糖和木糖等為底物代謝乙酸、丁酸和己酸等短鏈脂肪酸的功能，主要是通過短鏈脂肪酸逆β-氧化代謝途徑[24-25]；窖壁泥中的Aminobacterium與銨態氮呈極強正相關，Aminobacterium不僅可以降解氨基酸生成乙酸和丁酸等，也可以降解氨基酸增加銨態氮的含量[26]，這可能是窖壁泥銨態氮的含量高于窖底的原因。

窖底泥和窖壁泥的理化指標存在差異，窖底泥的pH值和過氧化氫酶活性顯著高于窖壁泥；pH值越接近中性，窖泥的窖齡越老，優質窖泥的pH值接近中性，新窖泥和退化窖泥的pH值偏酸性[27]。pH值與Hydrogenispora呈較強的正相關，Hydrogenispora可產生醋酸鹽、乙醇和氫氣[28]，不僅可以降低窖泥總氫相對含量，升高窖泥pH值，優化窖泥的厭氧環境，還有利于乳酸降解菌的生長代謝。Hydrogenispora在老窖泥中相對含量較高，是優勢梭菌之一[29]。其能夠在長期被黃水浸泡的窖底泥中大量繁殖，說明該菌的耐酸性較強，這也可能是窖底泥微生物應對高酸厭氧環境代謝自我調節的機制。Hydrogenispora如何調節窖泥的pH值鮮見相關報道，后續研究該菌對pH值調節的機理可能對濃香型白酒發酵產酸調控提供新的思路。RDA發現影響窖底和窖壁泥的理化指標對細菌群落影響存在差異，pH值是影響窖底泥細菌群落的主要因素，特別是影響窖泥中的產酸細菌。發酵過程中，己酸菌會產生具有獨特風味的己酸，當pH＜4.5時，己酸菌的生長會受到抑制[30]。劉梅等[31]也發現pH值和細菌群落結構存在較大相關性，pH值反映了窖底、窖壁泥中細菌微生物群落的差異性。張會敏等[20]證實了窖泥中乳酸與pH值的相關性很強，降解乳酸將是提高窖泥質量的重要途徑。同時理化指標在窖泥老熟時是一個動態變化的過程，若能在發酵過程中及時調控會有利于白酒風味的提升。

4 結 論

本實驗系統研究了濃香型白酒窖底泥和窖壁泥5 項理化指標和細菌群落結構，pH值、腐殖質、過氧化氫酶在窖底和窖壁泥中差異顯著，pH值是對窖底泥影響力度最大的理化指標；Firmicutes是窖泥共同的優勢菌門，但在屬水平上多個優勢菌屬存在顯著差異，Hydrogenispora是窖底泥的標志性菌屬。上述研究結果表明pH值是窖壁窖底泥細菌群落差異的主要環境因素，并且與Hydrogenispora呈極強的顯著關系，窖壁泥和窖底泥細菌屬相對豐度的差異導致參與到酸代謝中酶類相對豐度的差異，后續應深入研究細菌與理化因子之間的調節機制，為窖泥功能菌的篩選和窖池的護理提供理論參考。