基于GC-MS及電子鼻技術結合化學計量法表征8 種白桃關鍵香氣的差異

劉格格，畢金峰，茍 敏，呂 健，吳昕燁，陳芹芹*

（中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工重點實驗室，北京 100193）

桃子（Prunus persica(L.) Batsch）是主要的經濟型核果，因其口感、香氣、色澤、質地、形狀和營養價值而備受贊譽[1]。世界上有3 000多個桃品種，而我國培育了1 000多個品質差異顯著的品種[2-3]，主要包括普通白肉桃、黃桃、油桃和蟠桃，其中以普通白肉桃居多[4]。香氣是衡量水果風味和產品品質的重要指標[5]，桃原料的香氣成分影響其加工產品的風味品質[6]，研究不同品種桃果實總體香氣的差異有利于原料品種培優及加工產品品質的提升。

電子鼻作為一種無損檢測技術，在果蔬總體香氣區分與果實質量控制等方面得到了廣泛應用[7-9]，其通過不同傳感器的響應實現對不同樣品總體香氣的有效區分，具有操作簡單和快速的優勢，但缺乏定性及定量方法[10]。張鑫[11]和范霞[12]等分別通過電子鼻技術對不同成熟度黃桃和不同貯藏期白桃的總體香氣進行有效區分。頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯用作為一種成熟的揮發性物質檢測技術在桃果實中得到充分應用，其可以對樣品中的揮發性成分進行定性和定量分析[13]，具有靈敏度高等特點。電子鼻聯合HS-SPME-GC-MS技術可以全面分析黃桃干脆片[9]和不同肉質桃子[14]中總體香氣的差異，劉學艷[15]和王永倫[16]等分別采用電子鼻結合HS-SPME-GC-MS技術并通過相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）和主成分分析（principal component analysis，PCA）實現了對勐海縣曬青茶和不同干燥條件下真姬菇菌柄與菌蓋中揮發性物質種類及其相對含量的鑒定。目前普通白肉桃[2,17]及桃汁[6]中的關鍵香氣成分已有相關研究，但是不同品種間白桃的關鍵香氣差異仍有較大研究空間。

本研究以8 個品種白桃為實驗對象，基于HS-SPMEGC-MS聯合電子鼻技術對不同品種白桃總體香氣輪廓及香氣成分進行定性定量分析，并結合化學計量法對比分析影響8 種白桃總體香氣的關鍵香氣成分，為白桃加工企業原料選擇提供一定的基礎理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白銀桃（B Y T）、隴蜜5 號（L M 5 H）、秋彤（QT）、新大久保（XDJB）、頤紅水蜜（YHSM）、崗山白（GSB）6 種白桃采自國家果樹種質北京桃種質資源圃，新川中島（XCZD）桃由現代桃產業體系昆明實驗站提供，頤紅蜜（YHM）桃由現代桃產業體系泰安實驗站提供。8 個品種白桃實物如圖1所示。

圖1 8 種白桃外觀形態圖Fig.1 Visual appearance of eight white-fleshed peach cultivars

2-甲基吡嗪（內標）、甲醇（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司；C7～C40正構烷烴（純度99%）美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

AUW220電子天平、GCMS-QP 2020 NX氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；PEN 3.5型電子鼻德國Airsence公司；CTC PAL RSI自動進樣機械臂廣州智達實驗室科技有限公司；DB-WAX型毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；5 0/3 0 μ m 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

桃子采摘后放置18 ℃條件下貯藏2 h，挑選九成熟、果實飽滿、色澤好、無機械損傷和無腐敗變質的新鮮白桃進行清洗，之后進行劈半、去核、切塊處理，將1 kg左右的白桃塊放入破壁機中以32 000 r/min打漿2 min，得到色澤均一、風味濃郁的漿狀樣品。得到的白桃漿立即使用或放置-40 ℃條件下便于后期使用。

1.3.2 電子鼻檢測

參考李嘉欣等[18]方法并稍微修改。取2.0 g漿狀樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，采用PEN 3.5型電子鼻進行檢測，載氣流速、進樣流速0.30 L/min；傳感器清洗時間180 s，采樣前等待15 s，樣品測試時間為60 s。

1.3.3 HS-SPME-GC-MS分析

1.3.3.1 HS-SPME條件

參考Gou Min等[19]方法并稍作修改。取2.0 g漿狀樣品置于20 mL頂空進樣瓶中，向頂空進樣瓶中加入0.6 g NaCl，并加入15 μL 2-甲基吡嗪（509.85 μg/mL，溶于甲醇溶液）作為內標，用聚四氟乙烯硅膠塞將頂空瓶口密封。萃取前將DVB/CAR/PDMS萃取頭在250 ℃老化30 min；樣品在45 ℃平衡30 min后，萃取40 min；萃取完成后在進樣口解吸3 min。

1.3.3.2 GC-MS分析

參考Gou Min等[19]方法并稍作修改。

GC條件：DB-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.2 5 μ m）；初始柱溫3 0 ℃，以4 ℃/m i n 升溫至150 ℃，然后以5 ℃/min升至240 ℃，并保持5 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，不分流模式進樣。

MS：質譜接口溫度250 ℃；離子源溫度為230 ℃；電子電離源；能量70 eV；檢測器電壓0.2 kV；質量掃描范圍m/z35～500；溶劑延遲時間3 min。

1.3.4 定性分析

質譜庫：對比分析樣品中揮發性成分質譜和NIST 17數據庫中標準化合物的質譜，選取相似度在80以上的組分，初步確定化合物。

保留指數（retention index，RI）：根據混合正構烷烴（C7～C40）標準品，與樣品保持相同的GC-MS條件，得到的保留時間計算揮發性化合物的RI。RI按式（1）計算：

式中：n和n＋1為正構烷烴的碳數；ti為i組分的保留時間（處于Cn和Cn＋1之間）/min；tn為正構烷烴Cn的保留時間/min；tn＋1為正構烷烴Cn＋1的保留時間/min。

1.3.5 定量分析

采用內標半定量方法。根據被測各組分與內標物峰面積的比值，計算求得各組分的含量，按式（2）計算：

1.3.6 ROAV分析

參考劉登勇[20]和王永倫[16]等的方法并稍微修改，首先計算各組分的氣味活度值（odor activity value，OAV），按式（3）計算：

式中：C為某組分的含量/（μg/kg）；T為該組分的感覺閾值/（mg/kg）。

在各組分OAV基礎上，將OAV最大的組分的數值定義為：ROAVmax=100，按式（4）計算其他組分ROAV：

式中：OAVi和OAVmax分別為某組分和ROAVmax的氣味活度值；Ci和Cmax分別為某組分和ROAVmax的含量/（μg/kg）；Ti和Tmax分別為某組分和ROAVmax組分的感覺閾值/（mg/kg）。

1.4 數據處理

使用Excel 2019進行數值計算；使用MetaboAnalyst（www.metaboanalyst.ca）對電子鼻及GC-MS數據進行分析并繪制PCA圖；使用OriginPro 2021軟件作電子鼻雷達指紋圖和柱狀圖；使用Tbtools繪制香氣化合物聚類分析熱圖；使用在線免費平臺OmicShare tools（https://www.omicshare.com/tools）和Bioladder（https://www.bioladder.cn/）繪制Venn圖和Sankey圖。樣品均重復測定3 次。

2 結果與分析

2.1 電子鼻結果分析

2.1.1 雷達指紋圖譜分析

根據電子鼻傳感器響應值繪制雷達指紋圖，見圖2。W1W和W5S兩個傳感器的響應值存在差異，說明不同品種白桃中硫化物和氮氧化物的含量具有一定的差異。LM5H和GSB在W1W和W5S兩個傳感器中呈現相對最大和最小的響應值，說明這2 種白桃的總體香氣存在顯著差異。同時，8 種白桃在W2W和W1S兩個傳感器中產生不同的信號，但響應值均小于W1W和W5S，這說明不同品種白桃在芳香成分和甲基類物質含量上具有一定的差異。同時，嚴娟等[21]利用電子鼻技術研究桃果實中的香氣，證實硫化氫（W1W）、氮氧化物類（W5S）、甲烷類（W1S）、芳香成分與有機硫化物（W2W）傳感器在果實總體香氣評價中起主要作用，與本實驗結果保持一致。

圖2 不同品種白桃雷達指紋圖Fig.2 Radar fingerprint of electronic nose sensor responses to eight white-fleshed peach cultivars

2.1.2 PCA結果

基于電子鼻不同傳感器響應值結果進一步進行PCA（圖3），PC1和PC2貢獻率分別為98.83%和0.52%，累計貢獻率達到99.35%，可以反映出8 種白桃之間總體香氣的差異[22]。XCZD、LM5H和BYT之間距離較近，說明其總體香氣具有較高的相似性，GSB距離XCZD、LM5H和BYT之間較遠，說明它們之間的總體香氣差異相對較大，YHM、YHSM和XDJB之間相對于其他樣品距離較近，說明彼此之間香氣存在一定的相似性。不同品種白桃的揮發性成分對PEN 3.5電子鼻中10 個傳感器的敏感度不同，對最終結果產生一定的影響[23]。因此，在電子鼻分析桃總體香氣輪廓差異的基礎上，進一步采用GC-MS對其揮發性成分種類及含量進行鑒定分析。

圖3 不同品種白桃樣品PCA圖Fig.3 PCA plot of eight white-fleshed peach cultivars

2.2 揮發性成分分析

已有研究表明酯類、內酯類、醛類、醇類和酮類物質是桃中主要的香氣成分[22]。對HS-SPME-GC-MS技術檢測不同品種白桃中的揮發性成分進行分析，結果見表1，并繪制揮發性成分熱圖（圖4）。8 種白桃中共檢測到100 種揮發性物質，其中包括內酯類8 種、酯類14 種、醛類15 種、醇類26 種、酮類14 種、烷烴類11 種、酸類3 種和其他類揮發性物質9 種。其中BYT、LM5H、XCZD、QT、XDJB、YHM、YHSM和GSB樣品分別檢測到49、46、46、47、49、47、47 種和53 種揮發性化合物。Zhu Jiancai等[24]研究結果表明己醛、正戊醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-己烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛、（丙位）γ-癸內酯、（丁位）δ-癸內酯，(R)-(-)-芳樟醇和苯乙醛是桃子中重要的香氣活性物質，對桃子的總體香氣具有顯著的貢獻作用。酯類和醇類物質是蟠桃汁和鮮桃中重要的揮發性物質[25-26]，其中GSB樣品具有最多的酯類物質（14 種），而YHM具有相對較高的內酯類物質，含量為725.23 μg/kg。

表1 不同品種白桃揮發性化合物組成及含量Table 1 Composition and contents of volatile compounds in eight white-fleshed peach cultivars

圖4 不同品種白桃揮發性成分聚類分析熱圖Fig.4 Heatmap of cluster analysis of volatile components of eight white-fleshed peach cultivars

內酯類物質是桃果實的關鍵香氣成分，賦予桃果實“桃味”特征，是桃香氣的主要貢獻物質[27]，其中δ-癸內酯、γ-己內酯和γ-癸內酯是桃果實中重要的香氣化合物[28]，在本研究中，這3 種內酯類化合物也是8 種白桃共有的特征性香氣成分。YHM具有相對較高的γ-癸內酯和δ-癸內酯，含量分別為340.98 μg/kg和135.72 μg/kg，GSB擁有相對較高含量的γ-己內酯（354.54 μg/kg）。

酯類物質是桃子中果香型香氣屬性的主要來源[29]。乙酸己酯是8 種白桃樣品共有的酯類香氣化合物，但是其含量因白桃品種不同而存在較大的差異，這可能與不同品種白桃中脂肪酸代謝途徑中的關鍵酶的活性有關[28]。BYT和QT的乙酸己酯含量明顯高于其他白桃樣品，分別為762.38 μg/kg和640.52 μg/kg，GSB樣品中含有相對較多的酯類香氣化合物種類，為8 種。

呈青草型香味的醇類、醛類是桃果實中主要的芳香揮發物質[29]。不同品種白桃的醛類和醇類種類及含量相差較大，其中BYT具有最多的醛類物質（13 種），GSB具有最少的醛類物質（7 種），己醛在8 種白桃中含量分布在484.53（LM5H）～9 796.14（XDJB） μg/kg。GSB和XCZD中具有最多和最少的醇類物質，分別為17 種和10 種。YHM中芳樟醇含量最高，為3 605.28 μg/kg；LM5H具有最低含量的芳樟醇，為9.91 μg/kg。

檢測出的揮發性成分進行PCA，見圖5。PC1的貢獻率為67.50%，PC2的貢獻率為12.80%，二者累計貢獻率為80.30%，基本涵蓋8 種白桃樣品的基本信息。由圖4可知，QT和BYT遠離其他樣品，說明QT和BYT樣品與其他樣品存在明顯差異。8 種白桃之間沒有明顯的重疊現象，表明通過GC-MS分析很好區分不同樣品之間揮發性成分的差異。GSB和XCZD之間距離較近，說明GSB和XCZD樣品之間揮發性成分具有高度相似性，這與電子鼻PCA結果一致。桃果實呈現的總體香氣不是單一香氣物質作用的結果，而是由眾多揮發性成分之間、揮發性成分與非揮發性成分之間相互作用的結果[30-31]，這說明8 種白桃電子鼻PCA結果（圖2）與GC-MS分析的揮發性成分PCA結果（圖5）具有相似性和差異性。

圖5 8 種白桃中揮發性成分的PCAFig.5 PCA of volatile components in eight white-fleshed peach cultivars

2.3 ROAV分析

將OAV最大的香氣成分的ROAV定義為100。當某香氣成分的ROAV≥1，說明其對樣品總體香氣具有貢獻作用，是關鍵香氣化合物；當ROAV在0.1～1之間時，說明該香氣成分對樣品總體香氣具有修飾作用[32]。

ROAV的計算是基于香氣成分的含量及其在水中的感覺閾值共同作用的結果，能夠客觀評價8 種白桃揮發性成分的差異。經過ROAV分析，8 種白桃樣品中共鑒定出25 種對白桃總體香氣起到貢獻作用的揮發性成分，其中包含內酯類2 種、酯類3 種、醛類10 種、醇類4 種、酮類4 種、其他類2 種，結果見表2。電子鼻結果中W2W傳感器響應代表對芳香成分與有機硫化物響應，GSB具有最少的關鍵香氣成分，為13 種，且在電子鼻中W2W的響應值最低，二者結果保持一致，這說明關鍵香氣成分的呈現與電子鼻傳感器的響應相對應。

表2 8 種白桃中ROAV≥1的揮發性成分Table 2 Volatile components with ROAV ≥ 1 in eight white-fleshed peach cultivars

由圖6可知，醛類物質在各白桃樣品中種類數存在明顯差異，極差為15%（GSB最少，為18%；QT占比最多，為33%）。內酯類物質和醇類物質種類分布差異次之，含有較多內酯類物質和醇類物質的樣品均為GSB，占比分別為18%和38%；含有較少內酯類物質和醇類物質的樣品分別為QT和XCZD，占比分別為6%和26%。醛類物質和醇類物質是8 種白桃中種類較多、含量較高的揮發性化合物。

圖6 不同品種白桃揮發性物質種類分布百分比圖Fig.6 Distribution of volatile species in eight white-fleshed peach cultivars

基于ROAV進一步分析8 種白桃樣品總體香氣差異的來源，將8 種白桃樣品特有和共有的揮發性成分進行分析，見圖7。結合圖4和圖7結果發現8 種白桃共有13 種香氣化合物，分別為己醛、反式-2-己烯醛、乙酸反式-2-己烯酯、2-乙基己醇、芳樟醇、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、反式-2-己烯-1-醇、葉醇、γ-己內酯和γ-癸內酯。各白桃含有0～4 種特有香氣物質，這說明8 種白桃中香氣成分的濃度是造成不同品種白桃總體香氣存在差異的主要來源，與圖6結果一致。

圖7 不同品種白桃揮發性物質Venn圖Fig.7 Venn diagram of volatile species in eight white-fleshed peach cultivars

已知VIP評分用于突出對不同樣品聚類有貢獻作用的最具有區別性的特征[33]。為進一步篩選引起不同品種白桃總體香氣差異的來源，對ROAV≥1的揮發性成分進行VIP評分，見圖8。根據VIP評分結果，得出己醛、反式-2-己烯-1-醇、芳樟醇、正己醇、2-己烯醛和反式-2-己烯醛是VIP值大于1的關鍵揮發性物質，它們的濃度對于區分8 種白桃樣品具有重要的作用。

圖8 不同品種白桃揮發性物質VIP圖Fig.8 VIP values of volatile components in eight white-fleshed peach cultivars

基于VIP值大于1的分析結果，研究己醛、反式-2-己烯-1-醇、芳樟醇、正己醇、2-己烯醛和反式-2-己烯醛在8 種白桃中的分布情況。由圖9可知，ROAV≥1且VIP＞1的具有“青草味”的2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛與反式-2-己烯-1-醇、“花香味”的芳樟醇和“果香味”的正己醇的ROAV在8 種白桃中呈現顯著性差異（由Sankey圖連線粗細判別），結果說明8 種白桃關鍵香氣的差異與己醛、反式-2-己烯-1-醇、芳樟醇、正己醇、2-己烯醛和反式-2-己烯醛的濃度有關。

圖9 不同品種白桃VIP值大于1揮發性物質Sankey圖Fig.9 Sankey diagram of volatile compounds with VIP > 1 in eight white-fleshed peach cultivars

3 結 論

采用電子鼻結合HS-SPME-GC-MS開展了8 種白桃的總體香氣評價研究，電子鼻及HS-SPME-GC-MS的PCA結果均表明8 種白桃之間的總體香氣存在差異，電子鼻的雷達指紋圖表明不同品種白桃對W1W、W5S、W1S、W2W傳感器的響應存在差異；通過GC-MS共檢測出100 種揮發性成分，包括醛類、醇類、內酯類和酯類物質等，基于ROAV≥1且VIP＞1分析鑒定白桃中關鍵化合物為青草屬性的2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛與反式-2-己烯-1-醇、花香屬性的芳樟醇和果香屬性的正己醇，它們的濃度造成8 種白桃香氣屬性的差異，進而引起8 種白桃總體香氣的差異。