加味苓桂術甘湯對過敏性鼻炎大鼠的療效及免疫調(diào)節(jié)機制的研究

彭曉夏，逯曉青，弓 強，王世暉，竇志芳

（山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619）

過敏性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）又稱變應性鼻炎，是個體接觸過敏原后，由免疫球蛋白E（IgE）介導、多種免疫細胞和炎癥因子參與的鼻腔黏膜的變態(tài)反應性疾病，屬于I 型變態(tài)反應性疾病［1］。其發(fā)病機制尚不十分明確，近年來研究顯示輔助性T（T helper，Th）細胞在AR 的發(fā)病中起到重要作用，Th1/Th2細胞免疫失衡是AR 發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一［2，3］。目前多采用抗組胺藥物和鼻內(nèi)皮質(zhì)類固醇藥物治療AR，雖有一定療效，但這些藥物的耐藥性較強，副作用較大，復發(fā)率一直在增加。中醫(yī)藥對AR 的防治由來已久，并且具有安全、可靠、療效穩(wěn)定、副反應少等優(yōu)點，成為近年來研究的熱點［4］。加味苓桂術甘湯常用來治療過敏性鼻炎，療效顯著［5］。本研究在卵清蛋白誘導的AR 模型大鼠上，觀察加味苓桂術甘湯對大鼠行為學積分、血清IgE 水平、組胺的分泌和Th1/Th2 型細胞因子產(chǎn)生的影響，初步探討加味苓桂術甘湯在防治AR 中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選SPF 級Wistar 健康雄性大鼠60 只，6～7 周齡，體重200±20g，由北京維通力華公司提供。大鼠的飼養(yǎng)：每日定時清潔，飼養(yǎng)溫度20～25oC，相對濕度50%～70%，采用標準顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2 實驗藥物

加味苓桂術甘湯方藥組成：茯苓10g、桂枝10g、白術10 g、炙甘草6g、蒼耳子5g、細辛5g。上述中藥均由山西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥房提供。向每付藥中加入10 倍量的水煎煮1.5h，收集濾液；再向藥渣中加入水煎煮1.0h，收集濾液，合并兩次濾液，濃縮至50mL，4oC 保存?zhèn)溆谩Ｈ÷壤姿ㄆ◤V東逸舒制藥股份有限公司，國藥準字H20052214），用生理鹽水配制成2g/L 的藥液。

1.3 試劑與儀器

卵白蛋白OVA（美國Sigma 公司），氫氧化鋁（北京化工廠），生理鹽水（恒寧醫(yī)療器械有限公司），IgE、組胺、干擾素γ（IFN-γ）、白細胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海博士德生物有限公司）。Multiskan SkyHigh 酶標儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司），HC-2062 高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與模型構建 選取60 只健康成年雄性大鼠，適應性喂養(yǎng)1 周，隨機分為正常組15 只和造模組45 只。采用卵清蛋白（OVA）腹腔注射全身致敏聯(lián)合滴鼻強化致敏的方法處理造模組大鼠構建AR 模型［6］：首先進行全身基礎致敏，取1gOVA 和3gAl（OH）3溶于100mL生理鹽水中配置成混懸液，取1mL混懸液進行大鼠腹腔注射，隔天1 次，共7 次；然后進行鼻部強化致敏，從第15 天開始，取0.05mL5%OVA 混懸液滴入大鼠雙側鼻腔，1 次/d，共14 次。正常組大鼠基礎致敏階段給予等體積的3%Al（OH）3混懸液腹腔注射，鼻部強化致敏階段給予生理鹽水雙側滴鼻。末次滴鼻30min 后觀察大鼠抓鼻、打噴嚏和流鼻涕癥狀，統(tǒng)計行為學評分，具體評分標準如表1 所示，若總分≥5分，則可判定AR 模型建立成功。將AR 建模成功的40 只大鼠隨機分為模型組13 只、中藥治療組14 只和陽性藥物治療組13只。

表1 過敏性鼻炎反應行為評分標準

1.4.2 給藥方法 造模結束后，中藥組大鼠給予加味苓桂術甘湯10g/（kg×d）灌胃（按照人鼠藥物劑量換算公式計算給藥劑量），陽性藥物治療組給予氯雷他定生理鹽水1mg/（kg×d）灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1 次/d，共28d。

1.4.3 動物行為學觀察 向大鼠每側鼻孔滴50μL 卵清蛋白溶液，觀察大鼠在3min 內(nèi)撓鼻、打噴嚏的次數(shù)和流鼻涕的程度，按照過敏性鼻炎反應行為的評分標準（表1）進行打分。

1.4.4 血液樣本的采集 將末次灌胃給藥后的大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)24h 后，采集血液樣本。采用100g/L 水合氯醛腹腔注射處死大鼠，在眼底靜脈叢取血，4oC 離心（3000r/min×20min），取上清液，于-80oC 儲存、備用。

1.4.5 OVA-IgE、組胺、Th1 和Th2 細胞因子的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測大鼠血清中IgE，組胺，Th1 型細胞因子IL-2、干擾素-γ（IFN-γ）和Th2 型細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平。按照ELISA試劑盒的步驟進行檢測。

1.4.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用OriginPro 8.5 軟件進行作圖，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示。采用t 檢驗進行組間分析，P＜0.05 表示兩組之間具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 加味苓桂術甘湯對AR 大鼠行為學評分的影響（見表2）

表2 大鼠行為學評分比較（±s）

注：1）與正常組相比，P＜0.05；2）與模型組相比，P＜0.05

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2.2 加味苓桂術甘湯對AR 大鼠血清中IgE 水平的影響（見圖1）

圖1 加味苓桂術甘湯對大鼠血清IgE 水平的影響（*表示兩組間比較P＜0.05）

2.3 加味苓桂術甘湯對AR 大鼠血清中組胺水平的影響（見圖2）

圖2 加味苓桂術甘湯對大鼠血清組胺水平的影響（*表示兩組間比較P＜0.05）

2.4 加味苓桂術甘湯對大鼠血清中Th1、Th2 細胞因子水平的影響（見表3）

表3 大鼠血清中細胞因子水平的比較（±s）

表3 大鼠血清中細胞因子水平的比較（±s）

注：1）與正常組相比，P＜0.05；2）與模型組相比，P＜0.05

組別IFN-γIL-2正常組8.122±0.3434.049±0.269模型組3.725±0.2381） 2.963±0.0741）陽性對照組 6.844±0.5502） 3.673±0.1332）中藥治療組 6.678±0.6712） 3.629±0.0522）IL-4 22.211±1.460 33.665±4.8011）24.088±1.6122）25.473±1.5052）IL-5 17.120±0.763 26.455±3.4731）18.507±0.9362）20.138±1.2412）IL-10 2.530±0.315 4，563±0.7011）3.401±0.2452）3.403±0.1942）IL-13 2.487±0.272 4.200±0.5441）3.396±0.2342）3.691±0.2312）TNF-α 6.753±0.575 13.786±0.7671）9.263±0.9122）9.661±1.1592）

3 討論

AR 屬于中醫(yī)學“鼻鼽”的范疇，其主要癥狀為鼻塞、流清涕，是本虛標實之證，多由肺脾腎三臟陽氣虛衰，津液不化而成痰、成飲，痰飲內(nèi)停，又受外感邪氣誘發(fā)而作。“肺氣虛則鼻塞不利。”（《靈樞·本神》）肺開竅于鼻，肺主氣，司呼吸，主治節(jié)，具有通調(diào)水道之職，肺氣虛，不能攝津、布津，津液失司，則流清涕，津液停聚，阻塞肺之氣機，氣機不利則鼻塞。肺在體合皮，其華在毛，肺能夠宣發(fā)衛(wèi)氣以熏膚、充身、澤毛，肺氣虛，皮膚腠理不密，易受外邪侵襲，而發(fā)為鼻鼽。脾氣虛，運化失司，清陽不升而鼻竅失養(yǎng)。鼻為肺竅，乃清氣出入之道，脾氣虛，不能運化水谷精微，清竅失于濡養(yǎng)，則鼻塞不通。脾為生痰之源，脾氣虛，水濕運化失司，水濕內(nèi)停而為痰為飲，痰飲聚于鼻竅則成鼻鼽。腎者水臟，主津液，腎陽虛，氣化失司，水液失于氣化，而內(nèi)停為痰為飲。腎陽為一身陽氣之根本，脾陽根于腎陽，腎陽虛衰則肺脾陽氣均虛，肺脾腎陽氣虛衰，加重津液代謝失常，水不能化為氣而成痰成飲，加重鼻炎癥狀。此外，腎陽虛日久可以陰損及陽，而腎陰陽兩虛，導致鼻鼽纏綿難愈。

Th1/Th2 細胞之間的平衡與AR 的發(fā)生、發(fā)展及機體的免疫狀況密切相關，AR 患者體內(nèi)存在Th1/Th2 比例失衡的現(xiàn)象。本課題成功復制了AR 動物模型，ELISA 檢測顯示模型大鼠血清中IgE 和組胺的水平高于正常組，說明AR 大鼠存在過敏和炎癥反應；模型組大鼠IFN-γ 和IL-2 分泌減少，IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α 分泌增加，存在Th1/Th2 免疫細胞因子失衡的現(xiàn)象。

Th1 細胞能夠介導保護性免疫，抑制炎癥反應，增強免疫調(diào)節(jié)功能。IFN-γ 和IL-2 即是由Th1 細胞分泌的。IFN-γ 是抗呼吸過敏性疾病因子，是IL-4 合成的生物拮抗劑，可抑制IgE 的合成；IL-2 可促進NK 細胞增殖活化，抑制B 細胞合成IgE。Th1 細胞通過分泌IFN-γ 和IL-2 增強免疫調(diào)節(jié)功能，這與中醫(yī)藥健脾補腎益肺以扶正的作用具有趨同性。中醫(yī)認為脾胃為后天之本，氣血生化之源，“脾堅，則臟安難傷”（《靈樞·本臟》），脾虛，運化失職，水谷精微等營養(yǎng)物質(zhì)不能運化于全身，則機體免疫功能低下。腎陽為一身陽氣之根本，脾陽根于腎陽，腎陽虛，則脾陽亦虛，津液失于溫化、失于運化而內(nèi)停成痰，感受外邪則易發(fā)為AR。肺主氣，司呼吸，肺氣虛，則人體正氣不足，抗邪無力，服具有補肺作用的肺氣丸血清中IgG 含量明顯升高，反證肺與機體的免疫功能密切相關［2，3］。

Th2 細胞具有促炎作用，會加重炎癥反應，誘發(fā)AR。Th2 細胞分化增多，相關細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α分泌增加，導致IgE、組胺等病理產(chǎn)物聚集在鼻竅，發(fā)為AR。IL-4 是目前已知的能直接上調(diào)IgE 生成的細胞因子，能夠誘導B 細胞活化、增殖、分化及分泌IgE［1，5］；IL-5 抑制Th1 細胞的免疫反應，抑制IFN-γ 產(chǎn)生，間接促進Th2 細胞的免疫反應；IL-10 則阻礙Th1 細胞的激活；IL-13 促進黏液的分泌；TNF-α則促進炎癥反應、白細胞滲透、組織纖維化，是炎癥狀態(tài)的引發(fā)劑。AR 的主要病理變化為津液不化，壅塞氣道阻塞鼻竅，發(fā)為鼻塞、流清涕。這一病理變化與AR 發(fā)作時病理產(chǎn)物IgE、組胺聚集于鼻竅等病理現(xiàn)象有相似之處。

加味苓桂術甘湯由苓桂術甘湯加蒼耳子、細辛而成，方中茯苓、白術甘淡，能夠健脾利水而除濕；佐以桂枝辛溫，通陽化氣，溫復陽氣，陽氣復則氣行，氣行則津行，津行則水去痰化；甘草甘平，平補脾胃，并且調(diào)和諸藥，四藥合用溫化水飲，健脾利濕，以治飲成之本。現(xiàn)代藥理研究表明，茯苓具有增強免疫功能、抗炎、抗遲發(fā)性超敏反應的作用；桂枝具有抗炎、抗過敏作用；白術具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗菌作用；甘草能夠增強機體免疫調(diào)節(jié)功能，具有抑制肥大細胞脫顆粒、抗過敏的作用。細辛和蒼耳子均入肺，肺開竅于鼻，二藥辛散走竄，能夠直入鼻竅，進而通鼻竅、散風寒，以治其標。蒼耳子具有抗過敏、抑菌、抗炎和鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫抑制等作用；細辛在一定程度上可以修復受損傷的鼻黏膜，減少鼻黏膜上皮的脫落，減輕毛細管的水腫和充血狀態(tài)，還可以調(diào)節(jié)免疫平衡。苓桂術甘湯與二藥配伍溫中健脾，化痰利水，散寒開竅，既治肺脾腎虛衰之本，又治痰飲內(nèi)停，鼻竅阻塞之標，標本同治，進而有效地治療過敏性鼻炎。

本研究結果表明，灌服加味苓桂術甘湯后，治療組大鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平顯著升高，而AR 癥狀評分、血清IgE 水平、組胺分泌、細胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α 水平均顯著降低。說明加味苓桂術甘湯通過溫中健脾，升高大鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平以治AR 之本，通過散寒開竅降低血清IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α 水平，進而降低IgE 水平和組胺分泌，減少聚集在鼻竅的病理產(chǎn)物，宣通鼻竅，以治其發(fā)作之標。推測加味苓桂術甘湯防治AR 的作用可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞免疫平衡有關，然而關于其調(diào)控Th1/Th2 的作用機理還有待于后續(xù)深入研究。