過表達JAK1 對巖藻多糖保護神經元免受糖氧剝奪/復氧損傷的影響*

巨虎，翟婷，達哇卓瑪，劉川川

（1．青海大學附屬醫院，西寧 810001；2．青海大學高原醫學研究中心，西寧 810000）

腦缺血性疾病是造成患者死亡及殘疾的重要疾病之一，是指血管阻塞后不能及時將營養物質及氧氣運送至頭部，待血流再次匯通導致神經細胞壞死，造成腦缺血再灌注損傷（CIRI）[1-2]。研究表明，CIRI 是由多種因素聯合作用下而導致的，其中氧化應激、神經元凋亡、自噬等因素是近年來的研究熱點[3]。活性氧（ROS）是給機體造成氧化應激損傷的主要物質，當其含量過高時會損傷機體的蛋白質、DNA 及RNA，從而導致基因表達失活沉默[4]。細胞凋亡是細胞在基因控制下出現自主有序的死亡情況，在CIRI 中主要表現為神經細胞凋亡[5]。而自噬與細胞凋亡關系密不可分，自噬可通過抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶表達從而降解蛋白質及受損細胞器，以起到維持細胞平衡的效用[6]。

研究表明，中國缺血性心腦血管疾病占心腦血管疾病的70%～80%，給人們的生活及健康帶來嚴重威脅[7]。目前常以藥物溶栓進行治療為主，但治療后易出現神經細胞壞死或凋亡而難以達到較好的治療目的。近年來中成藥已經廣泛應用于腦缺血性疾病中的治療，并取得較好的成果[8]。巖藻多糖是從海洋無脊椎動物、海帶等動植物中提取出的活性成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗病毒及增強免疫力等功能[9]。且前期研究表明，巖藻多糖在認知功能障礙、神經前體細胞衰老、帕金森病、神經性疼痛等神級系統疾病中均有報道，在腦部具有緩解氧化損傷、炎癥及神經元細胞凋亡的作用，對CIRI 具有良好的治療作用，但其具體的致病機制還尚不清楚[10]。故本研究通過建立細胞缺氧缺糖/再灌注模型，對巖藻多糖是否通過抑制JAK/STAT 信號通路促進線粒體自噬，從而保護神經元免受糖氧剝奪/復氧損傷（OGD/RP）進行研究。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器巖藻多糖（上海源葉生物科技有限公司，貨號：S11142）；大鼠PC12 細胞（武漢Procell 公司）；胎牛血清、DMEM 培養（美國Gibco 公司，貨號分別為10100147、11885084）；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、Caspase-3、LC3B、PINK1、Parkin、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 抗體（武漢Abclonal 公司，貨號分別為：A0207、A0208、A2156、A19665、A7131、A19665、A18323、AP0530、A1192、AP0070）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（affinity 公司，貨號：S0001）；超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）ELISA KIT（上海茁彩生物科技有限公司，貨號：ZC-S0350、ZC-S0860）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、JC-1 試劑盒、ROS 檢測試劑盒、CCK8 試劑盒（上海beyotime 公司，貨號依次為：P0012、C2006、S0033S、C0037）；流式分析儀（美國Beckman 公司）；酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司）；透射電鏡（日本Hitachi 公司）；二氧化碳（CO2）培養箱（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 細胞培養及分組將大鼠PC12 細胞復蘇，在細胞中加入10%血清的DMEM 培養基后，將其置于37 ℃、5% CO2培養箱中，待細胞長至單層后用于后續實驗。將細胞分為Control 組、OGD/RP 組、100 mg/kg 巖藻多糖組、200 mg/kg 巖藻多糖組、400 mg/kg 巖藻多糖組、OGD/RP + 巖藻多糖+pcDNA-NC 組及OGD/RP+巖藻多糖+ pcDNA3．1-JAK1 組共7 組。

1.3 OGD/RP 損傷模型建立及用藥除Control 組細胞常規培養外，其余各組建立OGD/RP 損傷模型。待細胞生長至對數期時，將各組細胞培養液換為無糖培養基，并置于95%N2、1% O2厭氧條件下培養3 h，后置于正常培養箱中培養24 h，建立OGD/RP 損傷模型。將不同濃度巖藻多糖組、OGD/RP+巖藻多糖+pcDNA -NC 組和OGD/RP + 巖藻多糖+pcDNA3．1-JAK1 組細胞用巖藻多糖處理12 h。OGD/RP 損傷+巖藻多糖組+ pcDNA-NC 組和OGD/RP+巖藻多糖+pcDNA3．1-JAK1 組分別轉染pcDNA3．1空載質粒及轉染pcDNA3．1-JAK1 質粒到PC12 細胞中，并置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，培養24 h 后收取細胞進行檢測。

1.4 巖藻多糖濃度篩查將100、200、400 mg/kg 的巖藻多糖作用于PC12 細胞OGD/RP 模型中，用CCK-8 法篩選出抑制OGD/RP 模型細胞損傷的最大濃度用于后續實驗研究。在96 孔板中加入100 μL 細胞懸液，貼壁后棄上清加入100 μL 各組的試劑，孵育24 h；加入10 μL 的CCK-8 混勻并孵育4 h；用酶標儀測定450 nm 波長下的吸光度。

1.5 細胞凋亡檢測收集細胞離心后棄上清，加入磷酸鹽緩沖溶液（PBS）重懸后進行細胞計數；取5 萬重懸細胞，離心后棄上清，加入195 μLAnnexin V-FITC 結合液后孵育15 min；加入5 μL 碘化丙啶染色液后孵育5 min；用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡程度。

1.6 細胞ROS 活性測定收集各組細胞，離心并棄去上清，每管加入用DMEM 培養基按1∶1 000 稀釋的DCFH-DA 混勻，孵育20 min；后用DMEM 洗滌3 次，后用PBS 重懸；用流式細胞儀測定各組細胞的ROS 活性，采用CytExpert 軟件分析流式ROS結果。

1.7 線粒體膜電位（MMP）測定收集各組細胞，經PBS 洗滌后，按照JC-1 試劑盒說明書進行操作，依次加入1 mL 的DMEM 培養基及JC-1 染色液，37 ℃、5% CO2孵育30 min，后用JC-1 染色緩沖液洗滌3 次，棄上清后加入2 mL 的DMEM，用流式細胞儀觀察結果，用CytExpert 軟件分析流式JC-1 結果。

1.8 抗氧化酶SOD 和GSH-Px 水平收集每組培養的細胞，每組重復3 次，后按照ELISA 試劑盒的操作方式對抗氧化酶SOD、GSH-Px 進行檢測。

1.9 透射電鏡觀察線粒體自噬將各組細胞收集后離心后棄上清，細胞經過戊二醛固定、乙醇及丙酮脫水、環氧樹脂浸透、包埋、超薄切片機切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛染色后，用透射電鏡觀察并進行圖片采集。

1.10 蛋白相對表達收集細胞后用蛋白試劑盒提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，后通過SDS-凝膠電泳、轉膜、封閉，后加入稀釋后的一抗（兔抗Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、Caspase-3、LC3B、PINK1、Parkin、JAK1、p -JAK1、STAT3、p -STAT3），4 ℃孵育過夜，加入二抗（羊抗兔），室溫孵育2～3 h，ECL 顯色試劑盒顯色后用凝膠成像儀拍照，分析其灰度值。以β-actin 作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.11 統計學方法實驗數據采用Graphpad8.4.3軟件分析，計量資料用表示均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 巖藻多糖作用濃度篩選各組細胞經過處理后顯微鏡下觀察到（見圖1A），與Control 組相比，OGD/RP 組細胞數量及增殖能力降低；與OGD/RP組相比，不同濃度的巖藻多糖組細胞數量增加，其中400 mg/kg 巖藻多糖組細胞數目增加最為顯著。巖藻多糖對OGD/RP 模型細胞活性的影響結果顯示（見圖1B），OGD/RP 組細胞活性較Control 組降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；不同濃度的巖藻多糖組細胞活性均有不同程度的增加，其中400 mg/kg 巖藻多糖組細胞活性升高（P<0.01）。綜上所述，選取400 mg/kg 的巖藻多糖劑量用于后續實驗研究。

圖1 巖藻多糖對OGD/RP 模型細胞活性的影響Fig.1 Effect of fucoidan on activity of OGD/RP model cells

2.2 巖藻多糖通過線粒體自噬對PC12 細胞OGD/RP 損傷的影響

2.2.1 巖藻多糖對OGD/RP 損傷細胞凋亡的影響流式結果顯示（見圖2A），OGD/RP 組與Control組相比細胞凋亡率增加，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組與OGD/RP 組相比細胞凋亡率降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。Western Bolt 檢測結果顯示（見圖2B），OGD/RP 組與Control組相比Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase-3/Caspase-3 的表達量增加，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組與OGD-RP 組比較發現Bax/Bcl-2、cleaved-Caspase-3/Caspase-3 的表達量降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。

圖2 巖藻多糖具有降低OGD/RP 模型細胞凋亡的作用Fig.2 Fucoidan can reduce apoptosis in OGD/RP model cells

2.2.2 巖藻多糖對OGD/RP 損傷細胞線粒體膜電位的影響根據JC-1 法檢測PC12 細胞線粒體膜電位（MMP）結果顯示（見圖3），OGD/RP 組的MMP值較Control 組降低（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組的MMP 值較OGD/RP 組升高（P<0.01），差異均具有統計學意義。

圖3 巖藻多糖促進PC12 細胞OGD/RP 損傷線粒體膜電位的表達Fig.3 Fucoidan promotes mitochondrial membrane potential expression in PC12 cells injured by OGD/RP

2.2.3 巖藻多糖對PC12 細胞OGD/RP 損傷中氧化應激標志物的影響細胞中ROS 檢測結果顯示（見圖4A-B），與Control 組相比，OGD/RP 組ROS 含量增加（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組與OGD/RP 組相比，細胞內ROS 含量降低（P<0.01），差異均具有統計學意義。通過ELISA 檢測各組細胞中抗氧化酶SOD、GSH-Px 含量結果顯示（見圖4C-D），OGD/RP組較Control 組相比，細胞中SOD、GSH-Px 的含量降低（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組較OGD/RP 組相比SOD、GSH-Px 的含量升高（P<0.01），差異均具有統計學意義。

圖4 巖藻多糖對PC12 細胞OGD/RP 損傷中ROS、SOD 和GSH-Px 含量的影響Fig.4 Effect of fucoidan on ROS，SOD and GSH-Px contents in OGD/RP injury of PC12 cells

2.2.4 巖藻多糖對PC12 細胞OGD/RP 損傷中線粒體自噬的影響透射電鏡觀察線粒體自噬結果可知（見圖5A），與Control 組相比，OGD/RP 組和OGD/RP+巖藻多糖組均出現了不同程度線粒體腫脹，可見部分細胞存在自噬，且存在溶酶體與自噬體融合的現象。OGD/RP+巖藻多糖組與OGD/RP 組相比，線粒體自噬數量增多。對線粒體自噬相關蛋白的檢測結果表明（見圖5B），OGD/RP 組較Control組相比PINK1、Parkin 蛋白的表達降低，差異具有統計學意義（P<0.05），Lc3B 無統計學差異；OGD/RP+巖藻多糖組較OGD/RP 組相比PINK1、Parkin 及Lc3B 蛋白的相對表達量增加，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01）。

2.2.5 巖藻多糖對OGD/RP 損傷細胞中JAK/STAT通路相關蛋白的影響根據結果可知（見圖6），OGD/RP 組與Control 組相比，細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT/STAT3 蛋白的相對表達量增加，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組較OGD/RP組相比，細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT/STAT3 蛋白的相對表達量降低，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01）。

圖6 Western blot 對JAK1/STAT3 通路相關蛋白的檢測Fig.6 Detection of JAK1/STAT3 pathway-related proteins by Western blot

2.3 巖藻多糖通過調控JAK/STAT 通路介導線粒體自噬對OGD/RP 損傷的影響

2.3.1 過表達JAK1 后細胞中JAK1 的表達水平及磷酸化水平測定根據Western Blot 結果可知（見圖7），與pcDNA-NC 組相比，pcDNA3.1-JAK1 組細胞中p-JAK1/JAK1 蛋白的相對表達增加，差異具有統計學意義（P<0.05）。

圖7 過表達JAK1 后細胞中JAK1 的表達水平及磷酸化水平Fig.7 Expression and phosphorylation levels of JAK1 in cells after overexpression of JAK1

2.3.2 巖藻多糖通過調控JAK/STAT 通路對線粒體膜電位的影響根據流式細胞儀檢測PC12 細胞線粒體膜電位結果顯示（見圖8），OGD/RP 組的MMP 值較Control 組降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP 損傷+ 巖藻多糖+pcDNA3.1 -JAK1 組與OGD/RP 損傷+巖藻多糖+pcDNA-NC 組相比，細胞中MMP 值降低，差異具有統計學意義（P<0.01）。

圖8 過表達JAK1 對巖藻多糖作用細胞OGD/RP 損傷線粒體膜電位的影響Fig.8 Effect of fucoidan on mitochondrial membrane potential by regulating JAK/STAT pathway

2.3.3 巖藻多糖通過調控JAK/STAT 通路對OGD/RP 損傷細胞中氧化應激標志物的影響細胞中ROS 檢測結果表明（見圖9A-B），與Control 組相比，OGD/RP 組ROS 含量增加，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖組與OGD/RP 組相比細胞內ROS 含量降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP 損傷+ 巖藻多糖+pcDNA3.1 -JAK1 組與OGD/RP 損傷+巖藻多糖+pcDNA-NC 組相比細胞內ROS 含量增高，差異具有統計學意義（P<0.05）。通過ELISA 檢測各組細胞中抗氧化酶SOD、GSH-Px含量結果顯示（見圖9C-D），OGD/RP 組較Control組相比，細胞中SOD、GSH-Px 的含量降低，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP+巖藻多糖+pcDNANC 組組較OGD/RP 組相比，細胞中SOD、GSH-Px的含量升高，差異具有統計學意義（P<0.01）；OGD/RP 損傷+巖藻多糖+pcDNA3.1-JAK1 組與OGD/RP損傷+巖藻多糖+ pcDNA-NC 組相比，細胞中SOD、GSH-Px 的含量降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。

圖9 過表達JAK1 對巖藻多糖介導OGD/RP 損傷細胞的氧化應激標志物的影響Fig.9 Effect of overexpression of JAK1 on oxidative stress markers in OGD/RP-injured cells exposed to fucoidan

2.3.4 巖藻多糖通過調控JAK/STAT 通路對OGD/RP 損傷細胞線粒體自噬的影響根據透射電鏡結果可知（見圖10A），與Control 組相比，OGD/RP 組、OGD/RP+巖藻多糖組及OGD/RP+巖藻多糖組+pcDNA3.1-JAK1 均出現了不同程度線粒體腫脹，可見部分細胞存在自噬，且存在溶酶體與自噬體融合的現象；OGD/RP 損傷+巖藻多糖+ pcDNA3.1-JAK1組與OGD/RP 損傷+巖藻多糖+pcDNA-NC 組相比，細胞中線粒體自噬數目降低。Western Blot 對線粒體自噬相關蛋白的檢測結果表明（見圖10B），OGD/RP組較Control 組相比，細胞中PINK1、Parkin 蛋白的表達降低，差異具有統計學意義（P<0.05），Lc3B 無統計學差異；OGD/RP+巖藻多糖組及OGD/RP+巖藻多糖+pcDNA3.1-JAK1 組與OGD/RP 組相比，細胞中PINK1、Parkin 及Lc3B 蛋白的相對表達量增加，OGD/RP+巖藻多糖組增加更顯著，差異具有統計學意義（P<0.05）；OGD/RP 損傷+巖藻多糖+pcDNA3.1-JAK1 組與OGD/RP 損傷+巖藻多糖+ pcDNA-NC 組相比，細胞中PINK1、Parkin 及Lc3B 蛋白表達降低，差異具有統計學意義（P<0.05）。

圖10 過表達JAK1 對巖藻多糖介導OGD/RP 損傷細胞自噬的影響Fig.10 Effct of overexpression of JAK1 on fucoidan-mediated autophagy in OGD/RP-injured cells

3 討論

缺血性腦卒中（IS）由于患者大腦缺氧缺血引起的腦組織損傷的一種疾病，主要以失語、偏癱、癡呆等為主要臨床癥狀[11]。患者經藥物溶栓或血管內介入手術治療后引起血液復流易加重神經元細胞損傷，造成CIRI[12]。目前還尚未有有效藥物用于治療，故尋找抗神經元損傷的藥物尤為重要。前期研究表明，巖藻多糖對神經系統疾病具有較好的治療作用，如可通過抑制活化的膠質細胞，減少細胞凋亡及氧化應激而有效地保護神經元免受短暫性腦缺血的損傷[13]；而JAK/STAT 信號通路作為腦缺血再灌注損傷的重要機制通路之一，不僅參與神經細胞的凋亡、增殖與分化，而且還是參與機體缺血、缺氧和氧化應激等過程[14-15]。故推測巖藻多糖能夠通過抑制JAK/STAT 信號通路而促進線粒體自噬來改善CIRI。

氧化應激是指抗氧化劑與ROS 之間存在的一種不平衡的狀態[16]。ROS 產生于線粒體，在機體氧化應激損傷及維持機體正常生理活動起到重要作用[17-18]。當機體處于呼吸抑制或抗氧化能力衰退等不良條件下，線粒體膜電位的下降會導致機體中ROS 大量產生，對機體造成損害[19]。研究證明，ROS的大量產生是缺血再灌注損傷的標志性指標之一，可能是導致神經細胞損傷的重要原因[20]。SOD 和GSH-Px 分別為抗氧化劑及抗氧化應激酶，是機體內抗氧化能力的重要指標[21]。研究結果表明，巖藻多糖不僅能夠有效降低ROS 含量，增加機體中SOD和GSH-Px 含量，降低機體氧化應激的能力，而且還能通過降低線粒體膜電位，降低凋亡相關蛋白的表達，對CIRI 的治療起積極作用。

自噬是對受損或衰老的細胞器進行自主吞噬降解的過程，在CIRI 的過程中起著重要作用。Lc3B是自噬的標志性蛋白，能夠反應機體中自噬水平的高低。Pink1 和Parkin 作為帕金森病的主要致病蛋白，能夠通過介導線粒體自噬以維護線粒體穩定[22]。而Pink1 和Parkin 在機體內含量減少會降低受損線粒體的降解能力，導致細胞出現死亡。研究證實，自噬對CIRI 是一把雙刃劍，維持自噬在神經細胞中的穩態十分關鍵，通常認為在CIRI 的過程中神經細胞的自噬是處于上調狀態，但也不能排除是由于機體中自噬體清除率降低而導致的該現象。研究證實，再灌注期間能夠通過線粒體自噬清除損傷線粒體從而減輕CIRI；而在神經細胞中線粒體過度的自噬會造成有用的蛋白質和細胞器降解，從而加劇CIRI。研究表明缺血缺氧條件下造成的自噬會導致神經元細胞凋亡及損傷，且抑制自噬則會有降低CIRI 海馬區的細胞凋亡的作用[23]。研究表明，調控自噬相關蛋白可作為治療CIRI 的重要途徑之一。JAK/STAT 信號通路作為中樞神經系統的重要通路之一，不僅能夠調節機體的氧化應激，而且還對機體自噬具有一定的影響。Liu 等[24]表明能通過抑制JAK-STAT 可通過激活自噬對腸道缺血再灌注起保護作用；通過調節JAK2-STAT3 通路可改善CIRI后炎癥反應、氧化應激及對神經元凋亡發揮保護作用[25]。因此在本研究中鑒定巖藻多糖是否能通過JAK1/STAT3 相關蛋白來參與線粒體自噬的調控過程。研究結果表明，在OGD/RP 模型細胞過表達JAK1會促進p-JAK1/JAK1、p-STAT/STAT3 蛋白的表達，從而抑制線粒體自噬相關蛋白的表達。而巖藻多糖能夠降低OGD/RP 模型細胞中p-JAK1/JAK1、p-STAT/STAT3 蛋白的表達，促進線粒體自噬數量及自噬相關蛋白的表達，表明巖藻多糖能夠通過抑制JAK1/STAT3 通路的激活，促進線粒體自噬，減輕細胞的OGD/RP 損傷。

綜上所述，巖藻多糖對PC12 細胞的OGD/RP損傷具有較好的治療作用，其機制可能是通過抑制JAK1/STAT3 信號通路促進線粒體自噬而保護神經元免受糖氧剝奪/復氧損傷。