規(guī)模化養(yǎng)雞場A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及其對海南霉素敏感性的測定

耿 梅,趙艷利,蔣紅霞,侯慶明*

(1.山東勝利生物工程有限公司,山東濟寧 272000;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,國家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險評估實驗室,廣州 510642)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens, Cp)是一種革蘭氏陽性厭氧菌,又名為魏氏梭菌,能夠產(chǎn)生孢子,廣泛存在于土壤、污水、沉積物以及人和動物的消化道中,可以在環(huán)境中水平傳播[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌作為雞腸道中的常在菌,一般不發(fā)病,但在外界誘因下如患球蟲病,飼養(yǎng)衛(wèi)生條件不良,飼料營養(yǎng)缺乏等造成雞群機體抵抗力降低時,誘發(fā)壞死性腸炎(Necrotic Enteritis,NE)。目前該病已廣泛分布于世界各地,呈全球流行態(tài)勢,嚴重危害各國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。Cp所分泌的外毒素已經(jīng)達到 20 余種,基于其產(chǎn)生的外毒素 α、β、ε 和 ι的差異,將Cp分成A、B、C、D和E型[2],目前國內(nèi)流行的感染禽類的產(chǎn)氣莢膜梭菌主要是A型[3]。隨著限抗禁抗政策的落地,一些對產(chǎn)氣莢膜梭菌高敏的藥物被禁止使用。海南霉素是一種聚醚類抗球蟲藥,是我國具有知識產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)性藥物,用于防治雞球蟲病藥物且效果較好[4-5]。鹽霉素是第一種被中國引進的離子載體類藥,前期被廣泛應(yīng)用。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有很強的活性,特別是對腸內(nèi)的有害產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium)抑制力很強,但目前已被禁用。三丁酸甘油酯在幼齡動物上使用,有減少幼齡動物斷奶后的腹瀉,減少斷奶應(yīng)激,增加成活率和日增重的作用。在目前限抗、禁抗的養(yǎng)殖環(huán)境下可選擇藥物較少,且一些藥物易產(chǎn)生耐藥性,使得NE的問題愈發(fā)嚴重,給養(yǎng)殖帶來了巨大的困難[6]。本研究選擇了幾種不同的藥物對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果作了比較,以期為養(yǎng)殖中選擇有效的抗生素控制產(chǎn)氣莢膜梭菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及試驗菌株 2019年從廣東省某大型養(yǎng)雞場采集209份雞腸道樣本。參考菌株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124,質(zhì)控菌株脆弱擬桿菌ATCC25285和艱難梭菌ATCC700057均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理教研室。

1.2 主要試劑和儀器 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FT)、胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TSC)、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯(BHI)、水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH)、布氏瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;海南霉素、恩拉霉素、鹽霉素由山東勝利生物工程有限公司提供,丁酸甘油酯購自湖北浩華生物技術(shù)有限公司;PCR Mix、DNA Marker和瓊脂糖購自廣州擎科生物技術(shù)有限公司;微生物質(zhì)譜鑒定儀MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀)購自島津公司。

1.3 細菌的分離鑒定 將采集的雞腸道樣品置于3 mL FT培養(yǎng)基,厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)20 h。將增菌液劃線接種于TSC平板,厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24～36 h。挑單菌落劃線接種于含有卵黃的TSC培養(yǎng)基中,置于厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24～36 h。挑單菌落劃線接種于無菌含脫纖維綿羊血的哥倫比亞平板上,于厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24 ～36 h。挑單菌落進行增菌,采用MALDI-TOF-MS對疑似菌株進行菌種鑒定。將鑒定的菌株在 BHI 營養(yǎng)瓊脂平板上涂布,置于厭氧袋37 ℃培養(yǎng)36 h后,將菌苔刮取下來置于30%甘油BHI肉湯中,渦旋混勻后-80 ℃保存。

1.4 菌株分型 根據(jù)已發(fā)表文獻合成四種基因的引物,采用多重PCR方法對菌株進行分型[7]。反應(yīng)體系為25 μL,DNA模板2 μL、PCR Mix 12.5 μL、上下游引物(cpa、cpb、etx、iap)各0.125 μL、ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s共 30個循環(huán);72 ℃ 10 min(表1)。

表1 分型引物序列Tab 1 Typing primer sequence

1.5 藥敏試驗

1.5.1 藥物稀釋液的制備 按照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn),依據(jù)公式:質(zhì)量×效價=體積×濃度,計算所需抗菌藥物的量,配置成5120 μg/mL藥物稀釋液。海南霉素、鹽霉素用甲醇溶解,恩拉霉素用鹽酸溶解,丁酸甘油酯用DMSO溶解,藥物現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2 瓊脂稀釋法 挑選單菌落接種于3 mL營養(yǎng)肉湯中,厭氧培養(yǎng)12～18 h后用生理鹽水調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL。將制備好的菌液接種于強化布氏瓊脂平板,每點接種的菌量約為104CFU,質(zhì)控菌株為脆弱擬桿菌ATCC25285和艱難梭菌ATCC700057。每種菌株分別加入兩個未加藥物的平板作為生長對照,一個置于有氧環(huán)境檢測有無需氧菌污染,一個置于厭氧環(huán)境作為厭氧生長質(zhì)控的起點。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,判讀結(jié)果。

2 試驗結(jié)果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定 如圖1所示,挑取TSC平板中的黑色單菌落,劃線接種于含有卵黃的TSC培養(yǎng)基中。再選取在卵黃TSC板中呈黑色并有2～4 mm寬的白色沉淀環(huán)的單菌落,劃線接種于含無菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞平板,選取在血平板上形成雙溶血環(huán)的單菌落菌株,采用MALDI-TOF-MS對疑似菌株進行菌種鑒定。共鑒定出61株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率為29.2%。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(a. TSC卵黃囊瓊脂培養(yǎng)基,b.血液瓊脂培養(yǎng)基)Fig 1 Colony morphology of Clostridium perfringens on selective medium; a. TSC yolk sac agar medium, b. Blood agar medium.

2.2 分離菌株的分型 多重PCR方法對61株分離菌株分型結(jié)果顯示(圖2),所有菌株僅擴增到324 bp左右的cpa片段,因此判定所分離的雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖2 部分產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR分型結(jié)果(泳道M為DL2000;“-”為陰性對照;1～22為分離株;“+”為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13124)Fig 2 Partial mμLtiplex PCR typing resμLts of Clostridium perfringens

2.3 藥敏試驗結(jié)果 隨機選擇50株產(chǎn)氣莢膜梭菌進行海南霉素MIC值測定,10株進行恩拉霉素、鹽霉素和丁酸甘油酯MIC值測定。結(jié)果顯示菌株對海南霉素敏感性差異不大,總MIC值范圍為0.004～0.06 μg/mL之間,MIC50為0.008 μg/mL,MIC90為0.015 μg/mL(圖3)。10株菌株對恩拉霉素和鹽霉素均敏感,總MIC值范圍分別為0.004～0.06 μg/mL和0.008～0.06 μg/mL之間,對三丁酸甘油酯均不敏感,總MIC值范圍為64～>512 μg/mL之間。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌對4種藥物的MIC分布圖Fig 3 MIC distribution map of Clostridium perfringens for four drugs

3 討論與結(jié)論

產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道穩(wěn)態(tài)遭到破壞時則會誘發(fā)NE的產(chǎn)生,對養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害。據(jù)報道,NE 每年可造成全球養(yǎng)雞生產(chǎn) 20 億的經(jīng)濟損失[8]。Chalmers 等對加拿大的兩個肉雞場進行雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離,分離率分別為 24.72%、23.28%[9]。馬壯等報道2016 年產(chǎn)氣莢膜梭菌在廣州超市的冷鮮雞肉中的污染率為 68.68%且均為A型[10],由產(chǎn)氣莢膜梭菌A型引起的食物中毒是目前美國第二常見的食源性疾病[11],我國對因該病引起的食物中毒也屢有報道[12-13]。產(chǎn)期莢膜梭菌作為一種常見的食源性人獸共患病原微生物,可通過動物性食品傳播給人類,不僅危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展且對人類的健康有潛在的威脅,應(yīng)當(dāng)引起我們的重視[14]。

本研究中對廣東省某大型養(yǎng)雞場共采集了209份雞腸道樣本,分離鑒定出61株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率為29.2%,對菌株進行分析結(jié)果均為A型。陳祥杰等對珠三角地區(qū)的產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行情況進行調(diào)查,結(jié)果顯示陽性檢出率為35%,且都為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌[15]。陸宗浩等對澳門地區(qū)供應(yīng)的禽類食品進行產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究發(fā)現(xiàn),所分離到的均為A型且檢出率為37.5%[16]。產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離受養(yǎng)殖環(huán)境、抗生素的使用、采樣地區(qū)等因素影響,本研究中的分離率與分型結(jié)果與國內(nèi)其他研究大致相符。

據(jù)研究報道,球蟲感染后改變了雞腸道的PH,延長了有毒物質(zhì)排除體外的時間從而有利于產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道的增殖[17]。有試驗表明球蟲病可能使禽類易患NE,當(dāng)球蟲和梭狀芽孢桿菌混合感染時比球蟲單獨感染的癥狀更嚴重[18-19]。海南霉素主要用于防治雞球蟲病,為調(diào)查其對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用,隨機選取50個分離株進行抑菌試驗。結(jié)果顯示,海南霉素的MIC值范圍為0.004～0.06 μg/mL之間,MIC50為0.008 μg/mL。為了與其他藥物進行簡單的比較,隨機選取了10株進行恩拉霉素、鹽霉素和丁酸甘油酯的抑菌效果的研究。結(jié)果表明,海南霉素與對梭狀芽孢桿菌有強抑制性的恩拉霉素的抑菌效果相當(dāng),MIC值范圍為0.004～0.06 μg/mL,其次為鹽霉素,MIC值范圍為0.008～0.06 μg/mL。

產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridium Perfringens) 是一種革蘭氏陽性的專性厭氧桿菌[20],而海南霉素作為一種新型的離子載體抗生素,能夠較好的抑制革蘭氏陽性菌[21],因此,表現(xiàn)出了較強的抗梭菌效果。丁酸甘油酯有促進畜禽生長發(fā)育、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用,有研究報道在飼糧中添加丁酸甘油酯可對感染大腸桿菌的雞群有一定的保護作用[22]。本研究通過瓊脂法MIC對丁酸甘油酯的抑菌效果進行測定,結(jié)果表明丁酸甘油酯的抑菌效果不明顯。

本試驗從209份雞腸道樣本共分離鑒定出61株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率為29.2%,且均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。海南霉素不僅可以防治球蟲,對產(chǎn)氣莢膜梭菌也有良好的抑菌效果且與恩拉霉素相當(dāng),其次為鹽霉素,丁酸甘油酯的抑菌效果不明顯。