一測多評法在含生物堿類成分中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究

張 璐,龔旭昊,范 強,顧進華

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

中藥質(zhì)量控制和評價是制約其現(xiàn)代化的瓶頸之一。針對中藥多成分、多功效的作用特點,有學者基于中藥化學成分間存在的內(nèi)在關(guān)系提出了一測多評質(zhì)量評價方法[1],自提出后不斷有學者對方法的適應(yīng)范圍、方法學驗證、具體應(yīng)用等進行補充完善,關(guān)于QAMS研究的技術(shù)指南已被簡要概述和總結(jié)。隨著色譜分析技術(shù)的迅速發(fā)展,QAMS的應(yīng)用范圍愈加寬泛,在藥材種植、飲片炮制、工藝改進、制劑研究、新藥開發(fā)等領(lǐng)域取得了豐碩成果。

生物堿是許多中藥(Chinese medicinal materials,CMMs)的重要活性成分,其顯著的藥理活性和療效已被大量研究文獻和臨床應(yīng)用證實。中藥作為復雜體系的特點決定著單一成分難以準確全面表達中藥質(zhì)量,多成分測定是其質(zhì)量控制的有效手段和主要方向。生物堿質(zhì)量控制所需的多成分同步測定方法由于對照品的供需矛盾、高昂的檢測成本難以在實際生產(chǎn)、科研和監(jiān)管領(lǐng)域推廣應(yīng)用[2]。QAMS法則可較好解決這一難題。本文通過文獻研究,概述了QAMS法的理論基礎(chǔ),探究影響其應(yīng)用的關(guān)鍵要素,分析可能存在的問題并展望應(yīng)用前景,旨在為該方法在相關(guān)中藥的質(zhì)量控制應(yīng)用中提供一些參考。

1 生物堿類成分及分布簡介

生物堿是生物界除生物體必需的含氮化合物(如氨基酸、蛋白質(zhì)和B族維生素等)外所有含氮的有機化合物,一般具有較復雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),有似堿性質(zhì),廣泛存在于毛茛科、小檗科、木蘭科等雙子葉植物中,在單子葉植物中少見,僅個別動物含有。中藥化學成分中,生物堿是種類和數(shù)量僅次于萜類的第二大成分,采用生源結(jié)合化學結(jié)構(gòu)法對生物堿進行分類,可分為鳥氨酸系、賴氨酸系等8類,其中,苯丙氨酸和酪氨酸系生物堿在中藥中分布最廣,色氨酸系生物堿則是生物堿中數(shù)量最多的一類,總結(jié)生物堿的類型及結(jié)構(gòu)特點見表1,其在常用中藥中的分布及藥理活性見表2。

表1 生物堿分類及結(jié)構(gòu)特點Tab 1 Classification and structural characteristics of alkaloids

表2 生物堿類成分在中藥中的分布及主要藥理活性Tab 2 Distribution of alkaloids in CMMs and corresponding pharmacologic activity

2 一測多評法原理

QAMS法是一種適用中藥多成分質(zhì)量控制的檢測方法,用于對照品難得、制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類多成分同時測定。原理是在一定的線性范圍,成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比[11]。在多指標質(zhì)量評價時,以某一典型成分(易得、廉價、有效)為內(nèi)參物,建立其與其它待測成分間的相對校正因子(relative correction factor,RCF),無需其它對照品,通過RCF計算待測成分的量。

有學者歸納QAMS法為3個步驟:方法的建立、驗證和應(yīng)用,見圖1[12],建立同時測定內(nèi)參物對照品與待測成分含量的色譜法,對方法進行專屬性(分離度)、線性和范圍、檢測限和定量限、溶液穩(wěn)定性、精密度、準確度、耐用性考察,并選擇合適方法計算RCF,圖中所列計算方法為斜率法。綜合考慮外部因素(試驗環(huán)境、儀器、操作者等)、內(nèi)部因素(對照品、待測成分、內(nèi)參物、化學結(jié)構(gòu)等)對RCF的影響,并進行驗證。將求得的RCF代入公式應(yīng)用于供試品計算,運用合理的方法評價實測值與計算值之間的差異[13],充分證明方法的準確性、適用性和可行性。

3 QAMS在含生物堿類成分中藥控制中的應(yīng)用

目前,運用QAMS進行研究的單味藥及其炮制品已達二十余種。由于同一類化合物的結(jié)構(gòu)相似,紫外吸收接近,因此,大部分研究集中于有相似母核的化合物,例如黃連芐基四氫異喹啉類、苦參喹諾里西啶類等;也有對不同母核的化合物的研究,例如吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿屬于生物堿類化合物,吳茱萸內(nèi)酯屬于三萜類化合物。試驗常使用高效液相色譜法,新技術(shù)如高效液相色譜四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-QTOF-MS)法也已被引入使用。鑒于各研究的研究思路、技術(shù)路線基本相同或相似,故將所涉及單味藥、化合物以及各化合物之間的RCF歸納在表3中。

表3 QAMS在含生物堿類中藥成分測定中的應(yīng)用Tab 3 Application of QAMS in determination of alkaloids in CMMs medicine

QAMS法在含生物堿類中藥制劑中的應(yīng)用與在單味藥中的應(yīng)用相似,選擇復方中具有代表性且穩(wěn)定易得的有效成分作為內(nèi)參物,建立內(nèi)參物與其他待測組分間的RCF,將RCF作為常數(shù)來計算待測組分的含量。QAMS在含生物堿類中藥制劑質(zhì)量控制研究中已經(jīng)涉及到多種劑型,包括片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊劑、注射液等,建立QASM法對此類中藥多成分進行同時定性定量分析可以更全面、科學地控制質(zhì)量,提高臨床用藥的有效性和安全性,也更有利于中藥制劑的質(zhì)量控制和發(fā)展。目前,QAMS法在含生物堿類中藥制劑中的應(yīng)用迅速增加,是最具發(fā)展?jié)摿Φ馁|(zhì)量控制方法之一,將已開展QAMS研究的復方研究情況歸納在表4中。

表4 QAMS在含生物堿類成分的中藥制劑中的應(yīng)用Tab 4 Application of QAMS in traditional Chinese medicine preparations containing alkaloids

4 分析與討論

4.1 QAMS法應(yīng)用中的常見問題及解決方法 QAMS法源于內(nèi)標法、校正因子法、主成分自身對照法及紫外吸收系數(shù)法,根據(jù)在一定范圍內(nèi)檢測成分的量與檢測器響應(yīng)成正比的原理,利用相對保留時間(relative retention time,RRT)對色譜峰定性、相對校正因子(relative correction factor,RCF)計算待測物含量,因此待測成分色譜峰的定位、相對校正因子的計算、內(nèi)參物的選擇及色譜系統(tǒng)的適用性和穩(wěn)定性等是QAMS法應(yīng)用的關(guān)鍵。

4.1.1 如何定位待測組分色譜峰 中藥成分復雜,色譜圖中除待測成分色譜峰外,還存在多個其他色譜峰,因此待測成分色譜峰的正確定位是保證QAMS法準確測定的前提。雖然RRT法已經(jīng)被各國藥典(《美國藥典》、《歐洲藥典》和《中華人民共和國藥典》等)和文獻所采用,但由于色譜柱品牌型號繁多,即使運用同一類型填料的色譜柱也存在一些性能差異,導致計算的保留時間與實測保留時間誤差較大,色譜柱耐用性不佳[53]。目前色譜峰定位方法主要有以下兩種。

(1)王智民等根據(jù)保留時間提出的保留時間差法(ΔtRas)或相對保留值法(ras)[1],即采用待測成分與內(nèi)參物保留時間的差值或保留時間的比值定位,目前應(yīng)用較多。如譚靜玲等[40]建立了一清片中4種生物堿的含量測定方法,通過考察相對保留值和保留時間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重復性,最終采用相對保留值法對各待測組分進行定位。劉永利等[15]考察了4種高效液相色譜系統(tǒng)和6種色譜柱上ΔtRas與ras的重復性,結(jié)果顯示不同儀器與色譜柱對ras影響較大,不同儀器對磷酸可待因ΔtRas影響較大而對其他3種成分無明顯影響,說明各成分結(jié)構(gòu)不同,其影響因素各異,因此在色譜峰定位時應(yīng)多考察不同因素對ΔtRas與ras產(chǎn)生的影響,在條件允許的情況下,盡可能選擇對照品進行定位,以準確定位目標峰。

(2)孫磊等[54]提出的“雙標多測法”,原理是液相色譜中化學成分在不同色譜儀和不同色譜柱上的保留時間具有線性關(guān)系。劉軍玲等[55]建立雙標多測法定位補骨脂中補骨脂苷等4種成分。以補骨脂苷和補骨脂素為對照,通過研發(fā)的DRS origin軟件進行雙標線性校正預(yù)測特征峰的保留時間,結(jié)果表明雙標線性校正預(yù)測保留時間結(jié)果準確度高,顯著提高了色譜峰定性的準確度和色譜柱的適用性。“雙標多測法”在生物堿類成分一測多評中的應(yīng)用報道較少,趙倩等[50]在進行梔子金花丸一測多評時,分別選擇蒽醌類大黃素和生物堿類小檗堿進行兩點校正,定位效果優(yōu)于相對保留值法,提出該法應(yīng)用的前提是在不同系統(tǒng)或色譜柱下所有待測成分保留時間回歸曲線的相關(guān)性良好,即r>0.999,若再結(jié)合待測成分的紫外吸收光譜和梔子金花丸的標準圖譜則會大幅提高定位的準確性。

因此,色譜峰有多種定位方法。在研究時應(yīng)依據(jù)“深入淺出”的原則,充分考察每種方法應(yīng)用于色譜峰定位的準確性,選擇一種簡單可靠方法即可。必要時,可結(jié)合化合物的紫外吸收特征、對照圖譜等進行輔助確認。

4.1.2 如何計算相對校正因子(RCF) 根據(jù)一測多評法計算公式,相對校正因子要參與待測成分含量計算,因此需要獲取準確度高且適用性廣的相對校正因子,一般采用多點法或斜率法[56]。

多點法(average-relative correction factor,AVG-RCF)要求配制內(nèi)參物和待測成分的混合對照溶液,進樣不同濃度或不同體積,記錄內(nèi)參物與待測成分響應(yīng)值,按照公式fi/s=fi/fs=(Cs×Ai)/(Ci×As)計算,得到的fi/s取平均值,即為最后計算用RCF。式中As為內(nèi)參物的峰面積,Cs為內(nèi)參物的濃度(或量),Ai為待測組分的峰面積,Cs為待測組分的濃度(或量)。含生物堿類成分的中藥多使用多點法計算RCF。但此法容易受到待測成分濃度波動的影響,若選擇參與計算的濃度點超出了線性范圍,計算得到的f值帶入平均值計算會導致結(jié)果產(chǎn)生較大偏差。為此,有學者提出線性回歸方法計算RCF,即斜率法(linear regression-relative correction factor,LRG-RCF),需先建立內(nèi)參物的標準曲線,并獲得斜率。在標準曲線A=kc+b中,c=(A-b)/k=A/k-b/k,由于b值通常由系統(tǒng)或隨機誤差引起,若k/b值大于100時,b/k可忽略不計,則c=A/k。由于在一定線性范圍內(nèi),成分含量與檢測器的響應(yīng)值呈正比,即:c=f×A,那么校正因子f即為內(nèi)參物和待測成分標準曲線斜率比值,計算公式為fi/s≈ki/ks[57],式中ks為內(nèi)參物斜率,ki為待測組分斜率。斜率法是不同濃度點擬合而成的曲線斜率的比值,避免了離群濃度點帶來的計算誤差。

陳俊等[58]以延胡索為研究對象,采用多點法與斜率法分別計算原阿片堿等6種成分相對于內(nèi)參物延胡索乙素的RCF,計算得到的7種成分含量與外標法結(jié)果進行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果表明:外標法與兩種一測多評法之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.999,說明外標法和兩種一測多評法測得結(jié)果相似性極高。同時經(jīng)方差分析,P值遠大于0.05,說明三種方法計算結(jié)果無顯著性差異。

4.1.3 如何選擇內(nèi)參物 從表3、表4所列的內(nèi)參物和檢測成分來看,選擇的檢測成分是公認的與藥材(成藥)臨床功效具有相關(guān)性的指標成分或?qū)俪煞?選擇的內(nèi)參物還應(yīng)具備性質(zhì)穩(wěn)定、對照品來源有保障、價廉易得等特性以體現(xiàn)QAMS法簡便、易操作、低成本的特點,《中國藥典》黃連藥材標準項下小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量測定方法即為QAMS研究的典型實例[59]。趙倩等[50]選擇梔子金花丸QAMS內(nèi)參物時,黃芩苷、小檗堿、大黃素均符合內(nèi)參物要求,但在進行相對校正因子耐用性考察時發(fā)現(xiàn),以小檗堿或黃芩苷為內(nèi)參物時,某些成分的相對校正因子波動較大,以大黃素為內(nèi)參物時,各成分間的相對校正因子較穩(wěn)定。提示進行內(nèi)參物選擇時,還需分別建立與其他成分間的RCF并考察其重復性,必要時用外標法實測值對QAMS法結(jié)果進行驗證,選擇偏差最小的QAMS模型作為該中藥的質(zhì)量評價方法。若無滿足上述條件的化學成分,可以添加同類型結(jié)構(gòu)的化合物作為內(nèi)參物。如孫菡[15]等加入同為異喹啉型生物堿的鹽酸小檗堿為內(nèi)標,分別建立鹽酸吐根堿、鹽酸吐根酚堿的相對校正因子,從而計算藥材及制劑中兩種成分的量。

4.1.4如何評價QAMS法結(jié)果 QAMS質(zhì)量評價模式能否準確應(yīng)用于生物堿類成分含量測定關(guān)鍵在于計算結(jié)果的可靠程度。基于當前生物堿QAMS研究實例,多用外標法實測值與QAMS推算值進行比較。采用的比較方法主要有直接計算兩者偏差法、Pearson相關(guān)性分析、配對t檢驗等,其中計算兩者之間偏差應(yīng)用較多。QAMS法推算值與外標法實測值之間沒有顯著性差異,說明建立的RCF有良好的重現(xiàn)性和準確性,在缺乏對照品的情況下,可以用QAMS法對生物堿類成分含量進行同步測定。

4.2 影響QAMS法準確性的關(guān)鍵因素

4.2.1 建立良好的色譜系統(tǒng) 在QAMS重現(xiàn)性考察中,不同實驗室研究人員采用不同的分析儀器系統(tǒng)進行檢測,間接考察了流動相組成、色譜柱、柱溫、流速等因素對RCF的影響。其中,流動相組成可顯著影響色譜峰的分離度和峰參數(shù),若引起RCF偏差,需要優(yōu)化色譜條件進行調(diào)整。程中琴等[18]首次提出對色譜系統(tǒng)進行定量分析,對色譜條件進行了多方面的考察,包括色譜柱、柱溫、流動相系統(tǒng)組成、流動相pH,選取各組分對稱因子、峰寬、分離度平均值為評價指標,根據(jù)各參數(shù)對色譜圖評價的影響,分別賦予權(quán)重0.35、0.30、0.35,計算綜合評分(綜合評分=T/Tmax×0.35—W/Wmax×0.30+R/Rmax×0.35),通過比較各色譜圖綜合評分,優(yōu)選QAMS測定的色譜條件。

4.2.2 選擇適宜的檢測波長 目前,生物堿QAMS研究中常用的檢測器為紫外檢測器,對無紫外系數(shù)或紫外吸收弱的化合物,使用ELSD蒸發(fā)光散射檢測器作補充,例如徐彥等[34]采用HPLC-ELSD建立了卷葉貝母的“一測多評”法,同時測定其中貝母乙素和貝母甲素。對于紫外檢測器,根據(jù)待測物的結(jié)構(gòu)特征選擇合適的檢測波長至關(guān)重要,若無法兼顧各組分選用最佳波長,會降低各組分的定量限,影響含量測定。檢測波長的選擇有以下三種情況,一是選擇共有最大吸收波長區(qū),如梔子金花丸待測成分中,小檗堿和4個黃芩黃酮類成分在254 nm波長附近有明顯吸收,內(nèi)參物大黃素及其他4個大黃蒽醌類成分在254 nm波長處為特征吸收,在此波長下,供試品溶液中各待測成分色譜峰分離度良好,且峰純度檢查符合含量測定要求。因此,選擇了254 nm作為檢測波長[50]。二是綜合選擇峰數(shù)量多且基線穩(wěn)定的波長。如黃柏中黃柏堿、木蘭花堿與巴馬汀、藥根堿、小檗堿母核結(jié)構(gòu)不同,最大吸收波長不一致。對5種成分進行紫外吸收光譜并結(jié)合3D圖譜分析,選擇了5種成分都有較好吸收的波長作為檢測波長,雖然每個成分都不能實現(xiàn)最優(yōu)的波長檢測,但在一定含有量范圍仍然可以實現(xiàn)較為準確的定量[16]。三是在梯度洗脫過程中實現(xiàn)可變波長檢測。通過設(shè)置洗脫條件,根據(jù)待測成分的最大吸收波長分別選擇相應(yīng)的檢測波長。如梔子中梔子苷和西紅花酸類衍生物為不同類別的化合物,前20 min選擇梔子苷的最大吸收238 nm,后20 min選擇西紅花酸類最大吸收440 nm[60]。

4.2.3 確保對照品的純度準確 同類成分結(jié)構(gòu)及其相似(母核相同,取代基有微小差異)的同系物之間最大紫外吸收相近,RCF理論上應(yīng)該接近于1[61],但表3、表4中反映某些實際測定值卻偏離1,因?qū)φ掌芳兌炔粶蚀_造成RCF嚴重偏離現(xiàn)象需要引起關(guān)注。許多生物堿類對照品價格昂貴不易獲得,所使用的單體成分盡管已經(jīng)進行結(jié)構(gòu)鑒定和純度檢查,但未進行嚴格的純度標定,純度值或高或低,對實驗結(jié)果影響較大。建議盡可能采用原理不同的定值方法相互佐證,確保標定的純度結(jié)果準確。

4.2.4 科學進行樣品的前處理 樣品的前處理對成功分析藥品質(zhì)量起關(guān)鍵作用。尤其在QAMS應(yīng)用中,若某個有效成分本身含量較低,又不能被完全提取,檢測的濃度值過低,則極易受實驗儀器、檢測波長、對照品的純度等參數(shù)影響導致低于檢測限靈敏度、超出線性范圍或RCF值不準確。生物堿類成分可應(yīng)用酸提堿沉法提取分離,如斑花黃堇藥材中生物堿成分用堿沉后調(diào)節(jié)pH,用不同有機溶劑萃取,用紫外分光光度計在波長200～550 nm處掃描紫外吸收情況,根據(jù)吸收峰數(shù)量和吸光度大小確定提取方法[14]。梁穎欣等[25]在鉤藤生物堿的提取試驗中,通過考察不同聚酰胺加入量對各生物堿類成分吸附損失和去除鞣質(zhì)的程度來確定供試品溶液的制備方法。有研究提示,由于大多數(shù)生物堿在植物中以成鹽形式存在,用氨水浸潤后可使其游離而溶于有機試劑。因此,在提取生物堿時加入少量氨水可增加生物堿的溶出[58]。

5 意義及展望

QAMS法是利用一個對照品來實現(xiàn)對多個成分的同步測定,不僅可以節(jié)約成本,還能夠更加全面控制中藥質(zhì)量,可有效緩解對照品供應(yīng)不足與多指標定量評價之間的矛盾,已廣泛應(yīng)用于中藥材、中藥飲片、中藥提取物、中成藥等多種中藥領(lǐng)域。除生物堿外,QAMS法目前已經(jīng)實現(xiàn)了中藥復雜體系中黃酮類、酚類酸、皂苷類、木脂素類、蒽醌類等多種成分的同時定量分析。檢測范圍也從結(jié)構(gòu)相似的同類成分擴展到不同結(jié)構(gòu)母核的化學成分。

RCF的準確性是影響QAMS法準確應(yīng)用的關(guān)鍵參數(shù)。未來在試驗設(shè)計階段就應(yīng)充分考察不同因素對RCF的影響,例如環(huán)境因素(檢測時間、檢測人員、儀器設(shè)備、色譜柱)、操作參數(shù)(流動相組成、檢測波長、色譜柱長度、進樣體積、色譜柱溫度、對照品濃度)、峰檢測參數(shù)(不同狹縫寬度、譜帶寬、積分參數(shù))等,原則上不少于3家實驗室間進行驗證,以建立相對穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的RCF,并根據(jù)實際情況制定RCF的可接受范圍和應(yīng)用條件。在目標分子有較好分離度的前提下,RCF應(yīng)具有廣泛的適用性,可同時適用于不同劑型的成藥和藥材的多成分定量評價。隨著研究數(shù)據(jù)不斷集成,可考慮優(yōu)選經(jīng)典應(yīng)用實例建立QAMS—RCF數(shù)據(jù)庫,收錄各類成分的色譜條件及成分間RCF值,實現(xiàn)數(shù)據(jù)、方法共享,節(jié)約試驗成本,為更多中藥材和成藥的質(zhì)量控制及評價提供可靠參考,推動建立更完善的中藥質(zhì)量控制體系,實現(xiàn)中藥的傳承創(chuàng)新發(fā)展。