超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中沙拉沙星殘留的研究

傅 鳳,孟 蕾,楊 潔,吳寧鵬,張 寧,韓 立,劉婷婷,吳志明*

(1. 河南農業大學動物醫學院,鄭州 450002;2.河南省獸藥飼料監察所,鄭州 450008)

沙拉沙星(Sarafloxacin,SARA)是美國雅培公司在 1995 年研發上市,并獲得 FDA 批準的第一個可用于食用動物的氟喹諾酮類畜禽專用抗生素[1]。因具有抗菌譜廣、殺菌能力強,與其他抗菌類藥物無交叉耐藥性以及毒副作用小等優點,在獸醫臨床上被廣泛用于敏感細菌引起的泌尿系統、呼吸系統、消化系統感染以及霉形體病的治療[2]。但是不規范的使用會造成沙拉沙星在動物組織中的殘留,對幼齡動物骨骼生長發育產生不良影響[3];并且人類長期食用含有沙拉沙星殘留超標的動物源性食品,會對胃腸道、中樞神經、肝細胞產生危害,且容易誘導細菌耐藥性的發生[4]。為了控制沙拉沙星在動物性食品中的殘留,保障人民身體健康,國際食品法典委員會(CAC)、歐洲藥品管理局(EMA)、美國藥物食品管理局(FDA)和日本等對沙拉沙星制訂了最大殘留限量,我國GB31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》[5]和GB31650.1-2022《食品安全國家標準 食品中41種獸藥最大殘留限量》[6]中,規定沙拉沙星的最大殘留限量在魚的皮和肉為30 μg/kg,雞和火雞的肌肉為10 μg/kg、脂肪為20 μg/kg、肝為80 μg/kg、腎為80 μg/kg,雞和火雞蛋中為5 μg/kg。據報道,動物性食品中沙拉沙星殘留檢測的方法主要有高效液相色譜-熒光檢測法[7]、超高效液相色譜-串聯質譜法[8]、固相萃取-流動注射化學發光分析法[9]、時間分辨化學發光法測定[10]、高效液相色譜法[11]、酶聯免疫吸附法(ELISA)[12]等。其中測定雞蛋中沙拉沙星的檢測方法主要有高效液相色譜熒光法[13]、固相萃取-超高效液相色譜/串聯質譜法[14]。上述檢測方法普遍需要較為繁瑣的樣品前處理過程,費時費力,而且消耗大量的提取溶劑和固相萃取 (SPE) 小柱,增加了檢測成本和環保負擔。本研究擬建立雞全蛋及其蛋清、蛋黃中沙拉沙星殘留量測定的液相色譜串聯質譜法,為研究沙拉沙星在雞全蛋及其蛋清、蛋黃中的代謝規律,全面監控沙拉沙星在雞全蛋及其蛋清、蛋黃的殘留狀況,保障動物源性食品安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(美國Thermo Fisher公司,TSQ Quantiva);高速冷凍離心機(美國Sigma公司);電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);IKA MS3 basic漩渦儀(艾卡廣州儀器設備有限公司IKA中國);Milli-QA10 超純水儀(美國Milipore 公司);TTL-DCⅡ型氮吹儀(美國Organomation Associates公司)。

1.2 試劑與材料 沙拉沙星對照品(含量:99.6%)購自中國獸醫藥品監察所;沙拉沙星-D8(含量:99.8%)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)均購自德國Merck公司;試驗用水為經 Milli-Q凈化系統(美國 Millipore 公司)制備的去離子水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 1 mg/mL沙拉沙星標準儲備液 精密稱取沙拉沙星對照品約10 mg,于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成濃度為1 mg/mL的沙拉沙星標準貯備液,于-20 ℃以下保存,有效期3個月。

1.3.2 10 μg/mL沙拉沙星標準中間工作液 精密量取1.3.1項下溶液1 mL,于100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,制成濃度為10 μg/mL的沙拉沙星標準中間工作液,有效期1個月。

1.3.3 100 μg/mL沙拉沙星-D8內標儲備液 精密稱取沙拉沙星-D8對照品約1 mg,于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成濃度為100 μg/mL的沙拉沙星-D8標準儲備液,于-20 ℃以下保存,有效期3個月。

1.3.4 10 μg/mL L沙拉沙星-D8標準中間工作液 精密量取1.3.3項下溶液1 mL,于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成濃度為10 μg/mL的沙拉沙星-D8標準中間工作液,有效期1個月。

1.3.5 0.1 μg/mL沙拉沙星-D8標準工作液 精密量取1.3.4項下溶液100 μL,于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成濃度為0.1 μg/mL的沙拉沙星-D8標準工作液,有效期1個月。

1.3.6 1 mol/L磷酸溶液 取磷酸 7 mL,加水稀釋至100 mL,混勻。

1.3.7 0.1%甲酸溶液 取甲酸 1 mL,加水稀釋至1000 mL,混勻。

1.3.8 20%乙腈溶液(含0.1%甲酸) 取乙腈20 mL,甲酸100 μL,加水稀釋至100 mL,混勻。

1.3.9 20%乙腈(含0.1%甲酸)飽和正己烷溶液 取一定量正己烷,加入過量的20%乙腈(含0.1%甲酸)溶液,混合,靜置分層,取上層正己烷。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜參考條件 色譜柱:ACE Excel1.7 superC18柱(100 mm×2.1 mm,粒徑 1.7 μm);流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水;流速:0.3 mL/min;進樣量:2 μL;柱溫:40 ℃。梯度洗脫,見表1。

表1 流動相梯度洗脫Tab 1 Mobile phase compositions for gradient elution

1.4.2 質譜參考條件 離子源:電噴霧離子源;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應監測(MRM);噴霧電壓:3.1 kV;鞘氣:15 Arb;輔助氣:5 Arb;離子遷移管溫度:325 ℃;霧化溫度:300 ℃;離子對、錐孔電壓及對應的碰撞能量參考值見表2。

表2 定性定量離子對及對應錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 Qualitative and quantitative ion pairs and corresponding cone-hole voltage and impact energy

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品前處理 分別稱取均質后雞全蛋及其蛋清、蛋黃(2±0.02)g于50 mL離心管中,加入沙拉沙星-D8內標標準工作液100 μL,渦旋混勻后靜置15 min,依次加入1 mol/L磷酸0.5 mL,乙腈6 mL,渦動10 s。中速振蕩10 min,10000 r/min 25 ℃離心5 min,取上清液于50 ℃下氮吹至0.5 mL,用20%乙腈水(含0.1%甲酸)定容至1 mL。再加入20%乙腈(含0.1%甲酸)飽和正己烷溶液5 mL,低速震蕩30 s,靜置1 min后于8000 r/min離心10 min,取下層清液于15000 r/min 4 ℃離心15 min。取上清液過0.22 μm微孔濾膜,供液相色譜串聯質譜儀測定。

1.5.2 標準曲線的測定 精密量取適量標準中間工作液及內標標準中間工作液,用20%乙腈溶液(含0.1%甲酸)溶液稀釋成濃度為2、5、10、20、50 μg/L的系列標準溶液(內標均為10 μg/L),從低濃度到高濃度依次進樣,供液相色譜串聯質譜測定。以沙拉沙星與沙拉沙星-D8的定量離子色譜峰面積比為縱坐標,對應的沙拉沙星濃度為橫坐標,繪制標準曲線,求線性回歸方程和相關系數。

1.5.3 基質效應考察 分別取空白雞全蛋及其蛋清、蛋黃樣品(2±0.02)g,經前處理氮吹至0.5 mL后,加入適量的沙拉沙星和沙拉沙星-D8標準中間工作液,制成沙拉沙星濃度分別為2、5、10、20、50 μg/kg,沙拉沙星-D8濃度均為10 μg/kg的系列基質匹配標準溶液,再按照1.5.2標準曲線的測定項步驟繪制標準曲線。以基質標準曲線斜率(A)和相同濃度溶劑標準曲線(B)的比值考察基質效應(ME%=A/B×100%)。

1.5.4 檢測限與定量限的測定 分別取空白雞全蛋及其蛋清、蛋黃樣品(2±0.02)g,加入適量的沙拉沙星標準中間工作液,制成沙拉沙星添加濃度分別為0.2、0.5、1、2、5 μg/kg的試樣,每個添加濃度做5個樣品。按1.5.1 樣品前處理方法項處理樣品,再按1.4儀器條件項進行分析測定。依照信噪比S/N≥3要求為檢測限(Limit of detection,LOD),S/N≥10且滿足方法學回收率要求為定量限(Limit of quantification,LOQ)。

1.5.5 精密度與準確度的測定 分別取空白雞全蛋及其蛋清、蛋黃樣品(2±0.02)g進行添加回收試驗,添加濃度為1、10、20 μg/kg,每個濃度5個平行樣品,進行3次重復試驗,不同批次間隔24 h以上。按1.5.1樣品前處理方法項處理樣品,再按1.4儀器條件項進行分析測定。求平均回收率和批內、批間變異系數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線試驗結果 在1～25 ng/mL的添加濃度范圍內,沙拉沙星色譜峰面積與濃度呈現良好的線性關系,相關系數r大于0.999。標準曲線回歸方程與相關系數如圖1所示。

圖1 沙拉沙星標準曲線圖Fig 1 Standard curve of salafloxacin

2.2 基質效應考察試驗結果 結果如表3所示,經同位素內標沙拉沙星-D8校正后,沙拉沙星在雞全蛋及其蛋清、蛋黃三種基質中的基質效應在84.0%～99.2%之間,基質效應不顯著。

表3 空白雞全蛋及其蛋清、蛋黃中的基質效應Tab 3 Matrix effects in Sarafloxacin in blank eggs,albumens and yolks

2.3 檢測限與定量限試驗結果 試驗結果表明,當沙拉沙星添加濃度為0.5 μg/kg,藥物的信噪比(S/N)>3,當沙拉沙星添加濃度為1 μg/kg時信噪比(S/N)>10,平均回收率為96.5%,且此添加濃度為滿足方法學回收率要求的最低添加濃度。因此,最后確定雞全蛋及其蛋清、蛋黃的檢測限為0.5 μg/kg,定量限為1 μg/kg,色譜圖見圖2。

A:雞全蛋空白試樣中沙拉沙星特征離子色譜圖;B: 雞全蛋空白添加試樣中沙拉沙星特征離子色譜圖(1 μg/kg);C: 蛋清空白試樣中沙拉沙星特征離子色譜圖;D: 蛋清空白添加試樣中沙拉沙星特征離子色譜圖(1 μg/kg);E: 蛋黃空白試樣中沙拉沙星特征離子色譜圖;F: 蛋黃空白添加試樣中沙拉沙星特征離子色譜圖(1 μg/kg)A: Characteristic ion chromatogram of salafloxacin in egg blank specimens;B: Characteristic ion chromatogram of salafloxacin in spiked blank egg(1 μg/kg);C: Characteristic ion chromatogram of salafloxacin in albumen blank; D: Characteristic ion chromatogram of salafloxacin in spiked blank albumen(1 μg/kg); E: Characteristic ion chromatogram of salafloxacin in yolk blank;F: Characteristic ion chromatogram of salafloxacin in yolk spiked blank yolk(1 μg/kg)圖2 沙拉沙星和沙拉沙星-D8特征離子色譜圖Fig 2 Characteristic ion chromatograms of Sarafloxacin and Sarafloxacin -D8

2.4 精密度與準確度試驗結果 從表4可以看出,雞全蛋樣品中沙拉沙星在1 μg/kg、10 μg/kg及其20 μg/kg添加濃度范圍內,3次重復試驗的平均回收率在97.0%～101.4%之間,批內RSD在1.9%～9.0%之間,批間RSD在5.0%～8.4%之間。蛋清樣品中沙拉沙星在1、10、20 μg/kg添加濃度范圍內,3次重復試驗的平均回收率在97.2%～98.1%之間,批內RSD在1.8%～10.3%之間,批間RSD在5.8%～8.9%之間。蛋黃樣品中沙拉沙星在1、10、20 μg/kg添加濃度范圍內,3次重復試驗的平均回收率在98.1%～105.4%之間,批內RSD在1.3%～9.4%之間,批間RSD在2.9%～9.0%之間。

表4 空白雞全蛋及其蛋清、蛋黃中沙拉沙星的添加回收率及批內和批間RSDTab 4 Recoveries and intra- and inter-batch RSDs of salafloxacin in blank whole eggs, their albumens and egg yolks

根據上述結果可知,沙拉沙星在1、10、20 μg/kg濃度添加水平內的平均回收率范圍為97.0%～105.4% ,批內、批間RSD在1.3%～10.3%范圍之間。表明本方法的準確度和精密度較高,重現性好,滿足我國農業部獸藥殘留分析方法的要求[15]。

3 討論與小結

3.1 色譜條件的優化 比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水[16]等流動相體系,結果顯示流動相加入甲酸后可明顯改善沙拉沙星色譜峰峰型,而乙腈-0.1%甲酸水體系相較于甲醇-0.1%甲酸水體系,色譜峰響應更好,因此,選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

3.2 質譜條件優化 分別在正負離子模式下對沙拉沙星和沙拉沙星-D8進行調諧,結果顯示,在正離子電離模式下,兩者可獲得較高的響應值。對影響離子化效率的噴霧電壓、鞘氣流量、輔助氣流量、霧化溫度、離子遷移管溫度等條件進行了優化,最終結果顯示沙拉沙星和沙拉沙星-D8在噴霧電壓:3.1 kV;鞘氣:15 Arb;輔助氣:5 Arb;離子遷移管溫度: 325 ℃;霧化溫度:300 ℃的條件下獲得響應最強的分子離子峰。

3.3 提取液優化 據文獻報道,分別對5%氨化乙腈[17]、1%甲酸乙腈[18]和1 mol/L磷酸加乙腈[2]三種提取液進行考察,結果顯示(圖3),沙拉沙星在酸性條件下的提取效率高于在堿性條件下的。采用5%氨化乙腈提取時,提取液渾濁,容易造成固相萃取柱堵塞;采用1 mol/L磷酸溶液酸化后,再加入乙腈提取時,沙拉沙星的回收率最穩定,同時,蛋白的沉淀效果也最好。

圖3 不同提取液提取效率對比柱狀圖(n=5)Fig 3 Histogram comparing the extraction efficiency of different extracts

3.4 凈化條件優化 根據沙拉沙星的化學性質和雞蛋的化學組成成分,分別考察了通過式固相萃取柱:中性氧化鋁(AluminaN)、氨基(NH2)、 Prime HLB[13]固相萃取柱;離子型交換柱:PAX[19]和PCX固相萃取柱以及正己烷除脂后高速冷凍離心的凈化效果,結果顯示:①AluminaN柱、PAX柱絕對回收率分別為 71% 、67.3%,回收率較差;②NH2、Prime HLB柱及PCX柱的絕對回收率分別為 81.2%、73.7%、85.1%,回收率較①組提高,但凈化過程復雜,且凈化效果和③組相比差異較大;③正己烷高速冷凍離心后絕對回收率為 96.5%,回收率相對較高,且操作簡便。因此,選擇正己烷除脂后高速冷凍離心。

3.5 復溶液優化 分別考察了10%乙腈水、20%甲醇水、20%乙腈水(含0.1%甲酸)、30%乙腈水、50%乙腈水的復溶液。結果顯示,復溶液中加入甲酸會改善峰型且乙腈水比例為1∶4時峰型最好。因此,選定20%乙腈水(含0.1%甲酸)作為復溶液。

本研究建立的液相色譜串聯質法測定雞全蛋及其蛋清、蛋黃中沙拉沙星殘留,其檢測限為0.5 μg/kg,定量限為1 μg/kg,低于張展等[20]和王成真等[7]建立的HPLC-FLD法和高效液相色譜法中沙拉沙星的檢測限5 μg/kg、4 μg/kg和定量限10 μg/kg,本方法的靈敏度更高。與劉小東[21]、李丹[18]、蔣定之[16]等建立的高效液相色譜法、QuEChERs-高效液相色譜熒光法和PRiME-HLB固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法相比,本方法包含了雞全蛋及其蛋清、蛋黃3種基質,適用范圍更廣。與胡永萍等[13]、侯美玲等[14]建立的高效液相色譜熒光法和固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法相比,本試驗不使用固相萃取 ( SPE) 小柱,減少了檢測成本,前處理過程更便捷。與張玉潔等[22]建立的高效液相色譜法所得的62%～103%的平均回收率,0.3%～18%的批內、批間相對標準偏差相比,本試驗平均回收率為97.0%～105.4%,批內、批間相對標準偏差在1.3%～10.3%之間,本方法準確度和精密度更高。

本研究建立的液相色譜串聯質法測定雞全蛋及其蛋清、蛋黃中沙拉沙星的檢測方法,具有靈敏度高、覆蓋基質廣、前處理過程簡單快捷以及精密度和準確度高的優點,適用于雞全蛋及其蛋清、蛋黃中沙拉沙星殘留量的測定。