氣相和液相色譜法在氟苯尼考殘留檢測中的應用進展

徐婉婷,牛牧青,鄭永良,劉 暢,徐碧林,呂銳玲,范 霞,王 政*

(1.黃岡師范學院生物與農業資源學院,湖北黃岡 438000;2.華中農業大學生命科學與技術學院,武漢 430070;3.經濟林木種質改良及資源綜合利用湖北省重點實驗室,湖北黃岡 438000)

氟苯尼考(Florfenicol,FF),又名氟甲砜霉素,是動物專用抗菌藥物。氟苯尼考能與細菌70 S核糖體的50 S亞基緊密結合,降低肽酰基轉移酶的活性,從而抑制肽鏈的延伸,干擾細菌蛋白質的合成,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌均有抑制作用[1]。因其良好的抑菌效果,氟苯尼考被廣泛應用于治療牛、豬、雞等家禽和魚類的細菌性疾病[2]。隨著氟苯尼考的廣泛使用,其殘留問題也逐漸引起了人們的廣泛關注[3]。氟苯尼考的殘留主要表現在兩個方面,一方面是食品中的殘留,在畜禽、水產等動物性食品中殘留的氟苯尼考,可通過食物鏈傳遞,造成食品安全隱患,影響消費者健康[4]。另一方面,動物攝入的氟苯尼考不能被其完全吸收,會以母體或者代謝物的形式隨著糞便和尿液等排泄物排出體外進入到環境中,造成氟苯尼考及其代謝物在水體、底泥和土壤等生態環境的殘留和累積[5]。與此同時,環境中氟苯尼考的累積促進了氟苯尼考耐藥菌的富集和傳播,對公共安全造成了威脅。根據我國《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)中的規定,氟苯尼考的最大殘留限量為氟苯尼考及其代謝產物氟苯尼考胺之和[6],研究人員建立了很多針對氟苯尼考及其代謝物的檢測方法,其中色譜分析法是各種檢測方法中的金標準。氟苯尼考的色譜分析法主要有氣相色譜法和液相色譜法。二者也可與質譜串聯使用,稱為氣相色譜-串聯質譜法和液相色譜-串聯質譜法,均有高效、靈敏的優點,在水產品、畜禽產品和環境樣品檢測中都有應用[7]。本文對氟苯尼考及其代謝物的色譜檢測方法進行了綜述,對各檢測方法的優、缺點進行了分析,并對不同的前處理方法進行了比較,以期為氟苯尼考的殘留分析提供科學參考。

1 前處理方法比較分析

1.1 動物產品的前處理分析 氟苯尼考的分析測定過程中,除了定量方法的選擇外,樣品前處理是至關重要的一個環節。它將復雜體系中待測組分與基體進行分離,除去對分析測定有干擾的雜質,通過純化和富集以提高濃度,制成便于測定的溶液形式[8]。樣品的前處理直接影響到分析的效率和結果,樣品的種類和實驗條件不同,所用的提取方法和凈化方法不同(表1)。合適的前處理技術結合高靈敏度的檢測方法,才能獲得良好的檢測結果。氟苯尼考易溶于有機溶劑,所以提取液大多選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑。有研究比較了不同提取試劑對豬肉中氟苯尼考回收率的影響,發現甲醇和乙腈提取率較差,回收率較低;乙酸乙酯提取效果最佳,帶入的干擾物質較少,無須固相萃取小柱的凈化,簡化凈化過程,節約了樣品前處理的成本[9-10]。對于禽蛋樣品,蛋白質含量較高,而乙腈比乙酸乙酯的極性大,在提取目標化合物的同時可以沉淀蛋白,是良好的蛋白沉淀劑,能有效提取氟苯尼考。曾勇等[11]比較了乙腈、乙酸乙酯、甲醇三種試劑對禽蛋中氟苯尼考的回收率情況,甲醇回收率較低,而在禽蛋中加入堿性乙酸乙酯后樣品基質會變成果凍狀,無法充分提取,影響回收率。乙腈能有效提取藥物,再用正己烷去除脂肪等雜質,也可省去固相萃取步驟。樣品處理后用超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)分析,氟苯尼考的檢測限(LOD)為0.5 μg/kg,定量限(LOQ)為2.0 μg/kg,回收率為73.5%～81.7%。雞爪是家禽的副產品,但關于氟苯尼考在雞爪中的殘留檢測研究很少。Pokrant等[12]用水和丙酮提取雞爪中的氟苯尼考和氟苯尼考胺,加入二氯甲烷液液萃取凈化,再用液相色譜-質譜對分析物進行檢測。氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率為88.91%～115.83%,LOD均為50 μg/kg,LOQ均為56.8 μg/kg。液液萃取(LPE)和固相萃取(SPE)作為樣品預處理技術,主要用于樣品的分離和純化,但傳統的液液萃取和固相萃取技術具有持續時間長、消耗有機溶劑等缺點。Imran等[13]測定雞肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺時,先用氨化乙腈提取,乙酸乙酯二次提取。正己烷脫脂后,用封端C18材料進行分散固相萃取(dSPE),進一步對提取物凈化。氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率分別為91.6%～100.5%、86.4%～94.5%,LOD分別為0.73 μg/kg和0.58 μg/kg,LOQ分別為2.45 μg/kg和1.9 μg/kg。相比于傳統的固相萃取法,分散固相萃取具有快速、簡單的優點,并且不需要大量的溶劑來從吸附劑中回收分析物。Wei等[14]采用磁性分子印跡固相萃取(M-MISPE)與高效液相色譜紫外檢測(HPLC-UV)相結合的方法檢測雞蛋和雞血中的氟苯尼考。磁性雙模板分子印跡聚合物(DMIP)具有磁響應性,對氟苯尼考具有良好的吸附能力和選擇性。結果顯示,氟苯尼考的平均回收率為88.3%～99.1%,LOD為0.08 μg/kg。此檢測方法快速、靈敏度高、選擇性好,在動物樣品檢測中具有良好的應用前景。氟苯尼考的檢測方法一般是基于溶劑提取,然后去除雜質。氟苯尼考代謝研究表明,在雞、豬、牛和魚的可食用組織中,一些代謝產物對蛋白質等生物分子具有較強的結合親和力。這些結合的氟苯尼考殘基不能被有機溶劑直接提取,需要酸水解步驟來釋放結合殘基并將其轉化為氟苯尼考胺[15-16]。Shizuka等[17]開發了一種新的方法,先從樣品中釋放結合殘留物,然后將氟苯尼考及其代謝物轉化為氟苯尼考胺,最后檢測氟苯尼考胺的濃度。Shizuka測定牛組織和鰻魚中氟苯尼考殘留量,結果顯示,氟苯尼考的回收率為93%～104%,LOD和LOQ分別為10 μg/kg和0.5 μg/kg。該研究通過仔細優化樣品水解和凈化步驟,以最大限度地減少基質效應和分析物損失,開發了一種可靠的總氟苯尼考殘留檢測方法,通過使用溶劑標準品的外部校準實現準確定量,既不需要同位素標記的內標,也不需要基質匹配校準,具有很好的應用前景。Li等[18]通過酸水解與溶劑萃取相結合,對雞蛋中氟苯尼考總殘留量進行定量分析。樣品酸水解后用乙酸乙酯洗滌去除干擾物質,在堿性條件下用乙酸乙酯萃取,MCX固相萃取柱凈化,雞蛋中氟苯尼考胺的回收率為91.2%～102.4%,LOD和LOQ分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。動物產品中氟苯尼考的殘留檢測大多集中于可食用組織,而對于家禽羽毛研究較少。羽毛作為一種替代樣品材料,檢測家禽養殖中氟苯尼考的使用情況,可以在一定程度上解決干擾基質多、收集不便等問題。為了研究氟苯尼考及其代謝產物氟苯尼考胺在肉雞羽毛中的殘留情況,Cornejo等[19]用丙酮和水作為提取溶劑,再加入二氯甲烷進行液液萃取。氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率為99%～102%,LOD均為20 μg/kg,LOQ分別為24.4 μg/kg和24.5 μg/kg。

表1 不同類型樣品的前處理方法比較分析Tab 1 Comparative analysis of pretreatment methods for different types of samples

1.2 環境類樣品的前處理分析 環境樣品中抗生素檢測是評價環境安全的重要標準之一[20]。土壤、水和畜禽糞便等環境樣品都已經被檢測出來含有殘留的抗生素[21]。不同于動物性產品,環境樣品成分復雜,其提取的雜質更多,易對檢測分析造成干擾。對于土壤樣品中氟苯尼考的殘留檢測,用乙酸乙酯提取的雜質較多,凈化過程較為繁雜,而用甲醇、乙腈或丙酮提取,效果較好。張沖[22]建立了土壤中氟苯尼考殘留的檢測方法,甲醇提取,LC-18固相萃取小柱凈化。實驗比較了二氯甲烷、甲醇和乙睛對土壤中氟苯尼考的提取效果,其中甲醇提取效率最高,再輔以超聲提取,最終氟苯尼考回收率為82.5%。Xu等[23]同時檢測土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺。樣品用氨化乙腈提取,加入無水硫酸鎂和氯化鈉除水,PSA和C18吸附劑凈化后,震蕩離心,取上清液上機測定。結果顯示,氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率為73.6%～94.9%。此方法不用固相萃取柱凈化,是一種簡便,低成本,有效的測定方法。除土壤樣品外,還有一類環境樣品——畜禽糞便,近年來也逐漸受到了人們的關注。畜禽糞便基質復雜,前處理較為繁瑣,大多需要用固相萃取小柱凈化雜質。Wang等[24]采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測了畜禽養殖場中有機肥料中氟苯尼考的殘留濃度,用水:甲醇:丙酮(50∶25∶25,V/V/V)提取后,HLB萃取柱凈化。氟苯尼考的LOD為0.1 μg/kg,LOQ為0.5 μg/kg,平均回收率為76.6%～85.4%。Pokrant等[25]從糞便基質中提取氟苯尼考。將樣品均質后用乙腈和EDTA-McIlvaine緩沖液(pH 4.0)提取。無粘合劑的玻璃纖維濾紙過濾,HLB固相萃取柱凈化,氟苯尼考的LOD為11.2 μg/kg,LOQ為33.5 μg/kg,回收率為97.5%～99.2%。目前,關于畜禽糞便中氟苯尼考的殘留檢測文章較少,此方法可以為之后的殘留檢測提供參考。

總的來看,氟苯尼考提取液大多選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑,但不同類型的樣品中提取液的選擇不一樣。在動物產品分析中,乙腈是良好的蛋白沉淀劑,提出的雜質相對較少,可以省去固相萃取柱凈化這一步驟。對于土壤,糞便等環境樣品,提取過程中許多內源性物質無法得到有效去除,凈化過程較為復雜,需固相萃取柱過濾純化。相較于傳統的固體萃取技術,分散固相萃取技術快速、簡單,并且不需要大量的溶劑來從吸附劑中回收分析物。磁性分子印跡固相萃取無需固相萃取柱填料,只需外置磁鐵即可快速分離,耗時短,準確性高。

2 色譜分析

2.1 氣相色譜法 氣相色譜法(GC)是利用氣體作流動相的色層分離分析方法,原理如圖1所示,試樣被載氣(流動相)帶入色譜柱中,由于固定相對各組份的吸附或溶解能力不同,因此各組份從色譜柱流出的時間不同,組分彼此分離[26]。氟苯尼考含有硫酰基和亞氨基,有很強的極性且難揮發,在采用氣相色譜法分析此類化合物時,需對其極性官能團進行酯化、硅烷化或酰化,生成易揮發的衍生物[27]。如表2所示,氣相色譜對于氟苯尼考的殘留檢測在動物組織中應用廣泛。胡紅美等[28]用乙酸乙酯提取樣品,正己烷除脂,PSA吸附劑凈化,硅烷化試劑衍生化后通過氣相色譜法檢測水產品中氟苯尼考,結果顯示氟苯尼考在鯽魚、青蟹、南美白對蝦中的回收率分別為82%～93%、89%～96%和91%～93%,LOD為0.3 μg/kg。該方法回收效果較好,準確度也較高,可以滿足水產品中氟苯尼考的檢測要求。對于用乙酸乙酯提取,正己烷除脂后還是凈化不完全的樣品,則需要借助固相萃取柱,如MCX固相萃取柱、C18固相萃取柱來完成進一步的凈化[29-30]。孫豐云等[29]同時檢測了蝦肉中的氟苯尼考和氟苯尼考胺,提取劑為氨化乙酸乙酯。氟苯尼考胺呈堿性,極性高,故采用MCX固相萃取柱凈化,弱堿性的氟苯尼考胺在酸性溶液中呈離子狀態,通過陽離子交換作用保留在柱上,而氟苯尼考通過反向交換作用保留在柱上。結果顯示,氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率分別為89.0%～93.3%和86.3%～119.6%,LOD分別為0.4 μg/kg和0.2 μg/kg,LOQ分別為1.3 μg/kg和0.8 μg/kg。在胡紅美和孫豐云的研究中,分別用PSA吸附劑和MCX柱凈化,二者回收率和檢測限相差不大。對于氟苯尼考的檢測,PSA在乙酸乙酯中可吸附氟苯尼考,需用丙酮溶解提取物,在丙酮中用PSA凈化。MCX萃取柱能達到較好的凈化效果,但是,固相萃取需要進行活化、上樣、淋洗、洗脫等過程,步驟較多、過柱時間較長,不利于大批量樣品的檢測。

圖1 氣相色譜原理Fig 1.principle of gas chromatography

表2 氣相色譜檢測樣品中的FFTab 2 Determination of FF in samples by gas chromatography

上述文獻都是用的是氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)來檢測氟苯尼考。ECD是一個高靈敏度的檢測器,但只對具有電負性的物質,如含鹵素、硫、磷、氮的物質有信號,而對電中性(無電負性)的物質,無信號,這在一定程度上限制了它的使用[31]。質譜儀靈敏度高,樣品用量少,分析速度快,與氣相色譜相連實現對未知成分的分離和定性。氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)可根據樣品中待測組分在圖譜上的保留時間和此保留時間內殘留藥物分子裂解的特征離子碎片,由質譜儀對藥物進行準確定性,并以此作為定量的依據,從而克服了因雜質峰與藥物保留時間相同而將雜質峰誤認為藥物的缺點,因此氣相色譜-質譜聯用法廣泛用于復雜組分的分離和鑒定[32]。氣相色譜-質譜聯用法對樣品進行檢測之前,需對其凈化。水產品中殘留藥物的凈化一般采用液-液萃取法或固相萃取法。邵會[33]建立了氣相色譜法-質譜法同時測定6種水產品(中國對蝦、大菱鲆、鯽魚、鰻魚、蟹、甲魚)中的氟苯尼考和氟苯尼考胺。氟苯尼考脂溶性強,而代謝物氟苯尼考胺極性強。由于極性的差異,普通固相萃取柱對2種藥物同時凈化效果不太理想。他比較了陽離子交換固相萃取柱PCX、MCX柱以及反相吸附萃取柱HLB柱的凈化效果。結果表明,MCX柱凈化效果較好,這與已有的研究結果相符[34-35]。氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標回收率為76.4%～94.3%,LOD均為1.0 μg/kg,LOQ均為3.0 μg/kg。氟苯尼考的檢測分析中,固相萃取柱的選擇很關鍵,固相萃取過程中洗脫劑的選擇和用量也十分重要。氟苯尼考一般用甲醇洗脫,洗脫劑量小,不足以把目標物從小柱上洗脫下來;洗脫劑量大,會導致弱極性雜質洗脫出來,影響檢驗效果。喬青青等[36]探討了固相萃取柱洗脫劑的用量對藥物回收率的影響,當洗脫劑甲醇用量小于5 mL時,氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率在90%以下,而甲醇用量超過6 mL時才能充分洗脫,2種化合物回收率均在90%～110%,回收效果較好,LOD為0.5 μg/kg。

氣相色譜-質譜聯用法結合了氣相色譜和質譜的優點,因而具有靈敏度高、分析速度快、選擇性高等優點,可同時完成待測組分的分離和鑒定[37]。氟苯尼考在硅烷化后有幾個豐度較大的碎片離子,易于定性鑒別,所以氣質聯用法對氟苯尼考的殘留檢測靈敏[32]。

2.2 液相色譜法目前,國內外對氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留檢測方法較多,原理如圖2所示,國家標準規定的檢測方法以高效液相色譜法為主[38]。氣相色譜是利用惰性氣體的流動相進行分析,它的檢測對象主要是具有一定揮發性的物質,而液相色譜不受樣品的揮發性和熱穩定性的限制[39],不需要較繁瑣的衍生化步驟。因此,在氟苯尼考的檢測分析中,液相色譜應用范圍更廣泛[40]。高效液相色譜可根據待測樣品的特性以及實驗條件來選擇不同的檢測器來檢測分析[41],如紫外檢測器(UVD)、熒光檢測器(FD)及二極管陣列檢測器(PDA)和質譜檢測器(MSD)等,詳細內容如表3所示。紫外檢測器是高效液相中常用的檢測器之一,靈敏度較高,線性范圍寬,噪聲低[42]。李濤等[43]用高效液相色譜串聯紫外檢測器測定畜禽肉中氟苯尼考殘留量,樣品經乙腈提取,正己烷除脂,濾膜過濾后直接高效液相色譜儀分析。平均加標回收率為91.8%～95.2%,LOD為10 μg/kg,LOQ為30 μg/kg。此方法操作簡單,成本較低,適合畜禽肉中氟苯尼考殘留的檢測。相比于畜禽產品中氟苯尼考的檢測,飼料這類成分復雜的樣品,其凈化步驟也更加復雜,這增加了分析成本。Yang等[44]建立了薄層色譜-高效液相色譜法串聯紫外檢測器測定豬、雞、魚飼料中氟苯尼考的方法。氟苯尼考的回收率為80.6%～105.3%,LOD為20 μg/kg,LOQ為50 μg/kg。實驗對比了固相萃取柱和薄層色譜這兩種方法的凈化效果。結果顯示,凈化豬飼料樣品時,固相萃取不能有效去除干擾,而薄層色譜具有較好的分離效率和較低的成本。紫外檢測器分析樣品時,要求樣品必須有紫外吸收,且流動相的紫外吸收應盡可能的小,否則會有較大的本底吸收,影響結果。二極管陣列檢測器作為紫外檢測器的升級,可以克服普通紫外檢測器的缺點,給出的是色譜、光譜的三維譜圖,可以測出樣品中每一種物質的最大吸收,實現三維定性與定量分析,為分析工作者提供十分豐富的定性定量信息[45]。楊方等[46]用二極管陣列檢測器檢測鰻魚中氟苯尼考含量。采用乙酸乙酯提取樣品,在提取過程中,因鰻魚肉中有大量脂質及類脂物質同時被提取出,用正已烷除脂,再采用C18小柱凈化以除去水溶性雜質的干擾。結果表明,該方法的平均回收率為93%,LOD為9.1 μg/kg,LOQ為22.3 μg/kg。馬文瑾等[47]用液相色譜串聯二極管陣列檢測器檢測土壤中氟苯尼考及氟苯尼考胺。樣品自然風干后,用丙酮和水作為提取試劑,采用超聲輔助提取,再與二氯甲烷進行液液萃取凈化雜質。試驗測得土壤樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標回收率分別為90.16%～99.37%、67.63%～96.86%,LOD分別為10、15 μg/kg,LOQ分別為45、50 μg/kg。與畜禽樣品的提取方法不同,土壤樣品選用丙酮和水來提取氟苯尼考,回收率相對較高,而且提取出的內源性物質少,減少了雜峰干擾。熒光檢測器也是常用的檢測器,采用激光作為熒光檢測器的光源而產生的激光誘導熒光檢測器極大地增強了熒光檢測的信噪比,具有良好的選擇性。熒光檢測器的靈敏度很高,比紫外檢測器約高兩個數量級,其線性范圍比紫外檢測器窄。劉永濤等[48]和謝愷舟等[49]用高效液相色譜熒光檢測法分別檢測水產品和雞肉中氟苯尼考含量,最終LOD分別為5 μg/kg、1.5 μg/kg。二者樣品都用丙酮來提取,提取的內源性雜質較少,省去了固相萃取步驟,方法的藥物平均回收率分別為79%～90%和79.3%～82.5%。劉永濤和謝愷舟采用傳統的液-液萃取法提取氟苯尼考。為了簡化樣品的預處理及提高效率,Wang等[50]采用加速溶劑萃取(ASE)從樣品中提取目標分析物,結合超高效液相色譜-熒光檢測器測定禽蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留量。氟苯尼考和氟苯尼考胺的加標回收率分別為89.4%～98.6%、91.5%～98.0%,LOD分別為4.7、1.8 μg/kg,LOQ分別為10.5、4.3 μg/kg。此外,還比較了超聲提取、渦旋振蕩提取、ASE提取的效果。結果表明,ASE具有自動化、試劑消耗少、回收率高以及適用于樣品的批量處理等優點。比較上述三種檢測器,紫外檢測器目前在液相色譜方面應用范圍廣。二極管陣列檢測器可以測出樣品中每一種物質的最大吸收,這樣可以分別進行靈敏度最高的檢測,克服了普通紫外檢測器的缺點。但是,其價格相對昂貴,對于成熟的色譜條件分析沒有優勢,適合新產品的色譜條件開發、摸索。熒光檢測器靈敏度最高,檢出限最低,其適用范圍比紫外檢測器窄,僅適用于被激發后能產生熒光的物質。并且,對發生在熒光測量中的一些干擾非常敏感,在進行定量分析時,有必要驗證這些干擾是否存在,以及對樣品測定的影響程度,該缺點限制了熒光檢測器的應用。

圖2 液相色譜原理Fig 2.Principle of liquid chromatography

表3 液相色譜檢測樣品中FFTab 3 Determination of FF in samples by liquid chromatograph

高效液相色譜是通過監測與計算保留時間來對單個物質進行定性檢測的,但是兩個不同的物質可能具有相同的保留時間,這就會導致高效液相色譜在物質定性上可能存在不準確的情況[35]。高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)是通過使待測物質中各個組分在離子源中產生電離,通過質荷比的差異來對各組分進行定性分析,提高了檢測的靈敏度,也避免了假陽性結果的出現[51]。高效液相色譜-串聯質譜法測定氟苯尼考含量時,常用的定量方法有外標法和內標法,外標法是用待測組分的純品作對照物質,以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量。張偉瑋等[52]用高效液相色譜-質譜分析雞肉中殘留的氟苯尼考時,用標準品繪制標準曲線,外標法定量。結果顯示,氟苯尼考的峰面積與其濃度均呈良好線性關系。氟苯尼考的回收率為84.7%～95.2%,LOD為0.2 μg/kg,LOQ為0.5 μg/kg。內標法與外標法相對,是在測定樣品中某組分含量時,加入一種內標物質以校準和消除由于操作條件的波動而對分析結果產生的影響,以提高分析結果的準確度。殷平等[53]用液相色譜-質譜同位素稀釋法測定水產品中的氟苯尼考,采用同位素內標法定量,此法有機試劑消耗量少、操作步驟少且測定周期短。氟苯尼考在魚肉中回收率為78.6%～102.7%,在蝦肉中為73.5%～109.6%。LOD為1.5 ng/mL,LOQ為0.5 ng/mL。Xie等[54]選用內標法定量,高液相色譜-電噴霧電離串聯三重四極桿質譜(LC-ESI/MS/MS)同時分析雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺。在雞蛋樣品的預處理過程中,優化了提取劑以及乙腈飽和正己烷的體積,以更好地去除蛋白質和脂肪,從而提高了回收率,也節省了實驗成本。氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率為90.84%～107.84%,LOD分別為0.1、0.5 μg/kg,LOQ分別為0.3、1.5 μg/kg。外標法和內標法都是色譜分析中定量方法。外標法簡便,但對于進樣量要求準確,要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行,否則造成分析誤差,得不到準確的測量結果;內標法在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差,因而測定的結果較為準確。但內標法的操作程序較為麻煩,有時尋找合適的內標物有困難。超高效液相色譜(UHPLC)是指一種采用小顆粒填料色譜柱和超高壓系統的新型液相色譜技術,與傳統的高效液相技術相比,能大幅度改善液相色譜的分離度、靈敏度,極大地提高分析工作的效率和質量[55]。Li等[56]建立了一種用超高效液相色譜-質譜聯用測定中藥明膠中氟苯尼考殘留量的方法。氨水-乙腈提取藥物,加入胰蛋白酶來消除明膠藥物中蛋白質成分引起的基質效應,加入無水硫酸鈉、C18和PSA吸附劑來減少其他成分引起的基質效應。氟苯尼考的回收率為92.8%～102.7%。樣品中氟苯尼考的LOD和LOQ分別為0.4 μg/kg和1.5 μg/kg。Faulkner等[57]提出了一種有效檢測牛奶中氟苯尼考及其代謝物的方法,該方法采用MRM3采集技術,超高效液相色譜-質譜分析檢測。牛奶樣品鹽酸水解后調節pH到10以上,再用乙酸乙酯提取,分散式固相萃取進一步萃取凈化。氟苯尼考胺的回收率為92%～113%,CCα(Decision limit)為0.2 μg/kg,CCβ(detection capability)為0.34 μg/kg。與MRM(Multi Reaction Monitor)相比,MRM3改進了牛奶中較低水平氟苯尼考胺的選擇性檢測和定量。

3 展 望

不同色譜檢測方法各有優缺點。用儀器分析法檢測氟苯尼考時,氣相色譜法應用相對較少,主要是由于氟苯尼考不易揮發,在使用氣相色譜法分析時需要進行衍生化處理,樣品處理的成本較高。相比較而言,液相色譜法更適合氟苯尼考的檢測。液相色譜可與多種檢測器連接。其中,紫外檢測器和二極管陣列檢測器操作簡單,但靈敏度比熒光檢測器低。熒光檢測器靈敏度高,檢出限低,但只對熒光物質有響應。隨著科技的發展,高效液相色譜-質譜聯用技術提高了檢測效率,對于復雜的環境樣品,可以增加額外的分析能力,消除基質的干擾,準確鑒定和定量氟苯尼考,且檢出限低,靈敏度高。

對于復雜樣品,前處理是影響檢測結果的關鍵因素。關于氟苯尼考的前處理方法,還有待進一步改進,如通過轉化只檢測氟苯尼考胺一種檢測物,以提高檢測效率。與此同時,簡化色譜分析流程以縮短檢測時間也是實際檢測的需要,根據需要有效結合快速檢測方法與色譜分析方法也是未來的分析趨勢。總的來看,色譜法在動物產品和環境樣品的氟苯尼考檢測中發揮了重要作用,進一步完善色譜方法是食品安全檢測和環境風險評估的需要。