禽蛋和禽肉中獸藥殘留檢測技術研究進展

洪 璐,劉書余,郭亞文,高鵬飛,朱雅麗,謝愷舟*

(1.揚州大學動物科學與技術學院,江蘇揚州 225009; 2.揚州大學,教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室,江蘇揚州 225009)

近幾年我國肉制品的需求增長很快,隨著人均收入的提高及肉產品成本的下降,人們對于日常所需肉制品的數量及質量增高明顯,其中,禽類產品是優質蛋白的重要來源之一[1],其含有豐富的蛋白質、維生素及礦物元素,容易被人體吸收利用,雞蛋中更是富含卵磷脂,有營養大腦神經以及減輕肝損害等的作用,是人們日常飲食中不可缺少的一部分。同時,伴隨而來的食品安全問題也就越加嚴峻。在養殖業中,獸藥是畜禽疾病防治過程中最基礎且最關鍵的一道環節,它可以保證動物健康生長和生命安全,同時決定著一個企業的興衰以及消費者的健康。合理、科學地使用獸藥是每一個養殖企業經營的基本原則。但隨著人們對禽類產品的需求日漸增長,部分養殖企業,尤其是小型養殖戶為了謀取利益,不遵守休藥期、不按規定用藥以及在飼料中過度添加某些藥物而導致禽類產品中獸藥殘留超標問題日益加重[2]。為了監測和控制禽蛋和禽肉中有害物質的殘留,發展了不同的樣品前處理技術及獸藥殘留檢測技術,為大眾和環境的安全作保障。綜上所述,本文綜述了禽蛋和禽肉中獸藥殘留常用的前處理方法和測定方法,并對獸藥殘留檢測技術未來的發展進行了展望。

1 我國禽蛋和禽肉的獸藥殘留現狀

獸藥殘留種類主要包括抗生素類、磺胺類、呋喃類、抗寄生蟲類、激素和β-興奮劑等藥物的殘留[3]。其中,以促進禽類生長的激素、抗生素、磺胺類等藥物的殘留最為常見[4]。獸藥殘留的超標,可能引發慢性中毒和腸道菌群失調,甚至會產生“三致”(致畸形、致癌變、致突變)作用[5]。

禽蛋、禽肉中獸藥殘留主要來自家禽促生長時期和疾病防控時期,在這兩個期間,很多養殖戶因未按規定用藥,未嚴格執行休藥期等原因,導致動物源性食品中的獸藥殘留問題愈演愈烈,從而使藥物原型及其代謝物蓄積在家禽體內,并轉移到禽肉及禽蛋產品中[6]。

2022年,在我國農業農村部組織開展了的農產品質量安全監測工作中,抽檢了31個省份的屠宰場和養殖場共833個、農產品批發市場1191個。抽檢結果顯示,畜禽產品的合格率為99.1%。其中,禽肉和禽蛋類的抽檢合格率分別為98.7%和98.1%,合格率較其他的農產品低。

禽蛋、禽肉中的獸藥殘留種類繁多,問題不斷加劇的原因還包括養殖規模持續擴大、獸藥成分問題、檢測水平不夠及市場監管不到位等幾個方面[7]。本文結合GB 31650-2019、GB 31650-2022對禽蛋、禽肉中殘留獸藥及藥物的最大殘留限量進行了總結,如表1。

表1 GB 31650-2019、GB 31650-2022 中規定的禽蛋和禽肉中獸藥殘留的最大殘留限量Tab 1 MRLs of veterinary drug residues in poultry eggs and poultry meat in GB 31650-2019 GB、31650-2022

2 樣品前處理方法

禽類產品中蛋白質含量較高,尤以雞蛋中蛋白質含量最為豐富,在檢測過程中會對目標物的萃取凈化造成干擾,因此,選擇適宜的樣品前處理方法對殘留藥物的定性和定量至關重要[8]。前處理的步驟主要包括萃取、純化、分離、濃縮和復溶等。萃取和純化是最為關鍵的兩步。

目前,在禽類產品中運用較多的有液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、加速溶劑萃取(ASE)、QuEChERS[9]和基質固相分散萃取(MSPDE)等。

2.1 液-液萃取 液-液萃取,也稱兩相溶液提取,因樣品中各成分在兩種互不相容的溶液中存在著分配系數差異而能達成分離效果的萃取方法。萃取基本過程是將萃取液加入到樣品溶液中充分混合后,因濃度高低促使這些成分從樣品溶液中向萃取液中擴散,從而達到分離效果。曲良嬌等[10]用5%三氯醋酸來萃取雞肉中的五氯酚,經過五氯酚鈉(SLC)專用柱進化后,再用氣相色譜-質譜內標法進行樣品分析。五氯酚在5.05～202 μg/L濃度內線性良好,r=1.000,檢出限為0.06 μg/kg。Wang 等[11]利用乙酸乙酯提取雞蛋中喹諾酮類和磺胺類藥物,經過兩次濃縮過濾后,再用超高效液相色譜-質譜聯用法對樣品進行檢測分析,結果顯示,線性相關系數均在 0.9990以上,檢出限為 2～10 μg/kg-1。該法具有分離效果好、回收率高和適用性高等優點,但繁瑣費時,萃取溶劑易揮發,因此常與其他前處理方法配合應用。

2.2 固相萃取 固相萃取是一種液相色譜分離技術,是采用固體吸附劑將液體樣品中的目標物與干擾物分離,從而達到目標物的分離和集合。此方法已被許多領域廣泛應用。傅紅雪等[12]運用1∶1的乙腈-1%三氯乙酸溶液混合液為提取劑, 經Hilic Plus親水色譜柱凈化后, 運用全自動固相萃取結合液相色譜-串聯質譜法測定了雞肉中7種抗病毒藥物殘留。秦宇等[13]建立了用1% 甲酸乙腈為萃取劑,經新型固相萃取柱凈化后結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定了雞蛋中克倫特羅、恩諾沙星和金剛烷胺等 12 種禁用獸藥的殘留量,為雞蛋中多種獸藥殘留分析檢測提供了規范的依據。該法具備簡單、快速和通量高等優點,但固相萃取柱成本高且對環境有一定的污染。

2.3 加速溶劑萃取 加速溶劑萃取是一種只需利用少量基質,在一定的高溫和壓力下自動萃取基質中有機物的技術[14]。張健威等[15]建立了一種以甲醇和0.1 mol/L Mcllvaine緩沖液為萃取溶劑,利用加速溶劑萃取-固相萃取-超高效液相色譜/三重四極桿質譜法測定沉淀物中10種磺胺類抗生素的分析方法,結果表明,該方法檢出限為0.034～0.396 ng/g;平均回收率67.8%～109.8%之間,可應用于沉淀物中磺胺類抗生素的殘留檢測。該法具有操作簡單、省時、回收率顯著和對基質破壞度小等優點[16],但設備價格昂貴,成本較高[17]。

2.4 QuEChERS QuEChERS是由美國農業部開發的一種樣品前處理方法,廣泛應用于農畜產品的檢測,具有快速、高效和安全等特點[18],但過程中易受基質干擾。QuEChERS法凈化的基本過程是向水溶液中的固體樣品加鹽后經過乙腈萃取,接著經過液固萃取(也稱分散機制萃取)去除乙腈中存在的大部分干擾物,將萃取后的樣品直接進行質譜分析。呂警[19]以QuEChERS法萃取和凈化雞肉樣品,并結合液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)對樣品進行檢測分析,建立了一種可以快速測定雞肉中8種喹諾酮類藥物殘留量的方法。該法簡單、高敏、凈化效果明顯、所得平均回收率為89.7%～97.7%。圖雅等[20]用QuEChERS前處理法,結合超高效液相色譜-質譜法,建立了一種能夠快速篩查禽蛋(雞蛋、鴨蛋和鵝蛋等)中2種四環素類藥物殘留的方法,該方法靈敏度及準確度良好,所得平均回收率為80.5%～104.2%。

2.5 基質固相分散萃取 基質固相分散萃取(MSPDE)是一種將萃取物與待測樣品置于同一容器內研磨為半干狀態的混合物后作為材料裝柱,然后用不同的溶劑洗脫待測的殘留物[21]。該法是美國的Barker教授提出并進行了理論解釋的一種樣品前處理技術[22]。Zhang等[23]以分子印跡基質固相分散萃取技術并結合高效液相色譜(HPLC)法對樣品進行檢測分析,建立了一種可以系統監測雞肉中奧拉喹多克的便捷有效的分析技術,該法具有很好的識別性和選擇性,奧拉喹多司在1.0和2.0 μg/g-1水平的回收率范圍在85.3%～93.2%之間。該法具有操作簡單,高效和試劑消耗少等優點,在處理過程中可有效的減少樣品損失,但成本高、局限性高。表2總結了以上五種前處理方法的優缺點對比。

表2 不同樣品前處理方法優缺點對比Tab 2 Comparison of advantages and disadvantages of different sample pretreatment methods methods

2.6 其他樣品前處理方法 現今,隨著獸藥殘留檢測技術的不斷發展,已廣泛應用的樣品前處理方法還包括震蕩萃取(OE)、超聲萃取(UE)、旋渦混合萃取和沉淀法等[24]。這些方法都有精確度高,耗時短及成本低的優點。

3 常用檢測方法

目前,禽蛋、禽肉中獸藥殘留常用的傳統檢測方法有(超)高效液相色譜法[(U)HPLC]、(超)高效液相色譜-質譜法[(U)HPLC-MS]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)等[25]。

3.1 (超)高效液相色譜法 (超)高效液相色譜對于分子量高、氣化難度大、熱波動不穩定及高沸點獸藥的測定效果好。該法具備靈敏度高、分離效果好和對溫度變化不敏感等優點。高效液相色譜-檢測器主要有紫外線檢測器(UV)、熒光檢測器(FD)、化學發光檢測器(CD)和蒸發光散射檢測器(ELSD)等,可根據檢測目標選擇合適的檢測器。我國《食品安全國家標準雞可食性組織中地克珠利殘留量的測定高效液相色譜法》(農業部1927號公告-21-2013)[26]、《食品安全國家標準雞可食性組織中尼卡巴嗪殘留量的測定高效液相色譜法》(農業部1927號公告-11-2013)[27]中規定對雞蛋中氟喹諾酮類藥物、磺胺喹噁啉和泰樂菌素的殘留測定運用高效液相色譜法。劉暢等[28]以三氯乙酸-乙腈為提取劑,運用固相萃取結合高效液相色譜測定了禽類可食性組織和蛋中氨丙啉殘留,該方法精準度高,可用于禽肉及禽蛋中氨丙啉殘留的檢測。

3.2 (超)高效液相色譜-質譜法 近年來,(超)高效液相色譜-質譜法的發展很快,具有靈敏度高、分析速度快、樣品用量少和專屬性強等優點[29],因此,應用領域越來越廣泛,隨著該技術的發展,我國相關標準中對獸藥殘留的檢測大多運用液質聯用。隨著動物源性食品中的獸藥殘留越發復雜,出現多種或未被發現的化學物質殘留,我國需要發展更加全面的檢測技術和儀器,提升識別手段。陳濤等[30]建立了一種基于超高效液相色譜-質譜法同時測定雞蛋、雞肉、豬肉中酰胺醇類藥物殘留量的方法。晏亮等[31]運用5%甲酸乙腈溶液為提取劑,運用QuEChERS法結合超高效液相色譜四極桿飛行時間質譜法,建立了同時測定蛋及蛋制品中 5 大類 49 種藥物殘留的方法。該方法快速又簡便,大大提高了工作效率。奚照壽等[32]以乙酸乙酯-乙腈-氨水為提取劑結合高效液相色譜-串聯質譜法,建立了鵪鶉蛋和鴿蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代謝產物氟苯尼考胺多殘留的同時檢測方法。

3.3 氣相色譜-質譜法 氣相色譜-質譜法結合了氣相色譜和質譜的不同特性以鑒別樣品中不同物質,其原理是將待測樣本分子電離成不同質量電荷比的帶電離子進行分離[33]。目前,該法主要用于檢測食品中易揮發的小分子痕量化合物,其在獸藥殘留方面的應用沒有上述兩種方法廣泛。我國《食品安全國家標準 雞肌肉組織中氯羥吡啶殘留量的測定氣相色譜-質譜法》(GB 29699-2013)[34]規定了雞肌肉組織中氯羥吡啶殘留量的檢測標準。邢銀英等[35]以三重四極桿氣相色譜-串聯質譜法結合QuEChERS法,建立了禽源類肉及其肉制品中氟蟲腈及3種代謝藥物殘留的分析方法,該法準確度和靈敏度均很高。

4 其他檢測方法

常用的檢測方法所需儀器較大,耗費高且檢測環境有很大的局限性。如今,獸藥殘留檢測技術不斷的向著新的方向發展,國內外已廣泛應用于食品中的快速檢測技術包括免疫學檢測法、分子印跡技術、生物芯片技術、生物傳感器檢測法等。

4.1 免疫學檢測法 免疫學檢測法是一種廣泛應用于農藥殘留的檢測的方法,該法包括聯酶免疫檢測法、熒光免疫檢測法、膠體金免疫檢測法和免疫傳感器技術[36]。以酶聯免疫檢測法為例,其檢測原理如圖1,該法具有操作簡單、省時和準確率高等特點[37]。何方洋等[38]運用化學發光免疫分析法、酶聯免疫分析法和膠體金免疫層析法三種免疫學檢測法對動物源性食品(雞肉等)中的呋喃唑酮進行檢測,結果表明,發光免疫分析法、酶聯免疫分析法、膠體金免疫層析法對呋喃唑酮代謝物的檢測限分別為0.01、0.02、50 ng/L,發光免疫分析法和酶聯免疫分析法添加回收試驗的變異系數范圍分別為小于15.0%和小于8.0%。因此,不論是實驗室檢測還是戶外的批量樣本檢測,不同的免疫學檢測法在不同的應用條件下各有優勢。

4.2 分子印跡技術 分子印跡技術(MIT)是指用化學方法合成對目標物具有特異選擇性聚合物的過程[39],是利用模板記憶在聚合物基質中形成選擇性位點創建分子印跡聚合物(MIPs)的技術[40]。其檢測原理如圖2,該法具有靈敏度高、操作便捷、成本低、穩定性好等特點[41]。李橋[42]等運用分子印跡技術,以金屬有機骨架為穩定離子,通過皮克林乳液法制備了分子印跡中空微球,可用于檢測動物性食品中的阿莫西林,結果表明,分子印跡中空微球對阿莫西林有較大的吸附容量,吸附容量在318 K,100 mg/L的阿莫西林溶液中達到0.1376 mmol/g。Ma等[43]用二甲胺四環素的分子印跡納米聚合物聚合在金屬有機骨架材料表面,以該種新型復合材料為吸附劑,建立了分散固相微萃取方法,用于雞肉中7種四環素的超高效液相色譜測定方法。該復合材料對7種四環素具有較高的吸收能力,回收率可達92%以上,可重復使用8次。7種藥物的檢出限為0.2～0.6 ng/g,因此,該方法可用于肉類中四環素殘留量的多重檢測。

圖2 分子印跡技術原理圖Fig 2 Schematic diagram of molecular imprinting technology

4.3 生物芯片技術 生物芯片技術是一種利用雜交技術對食品基因進行檢測的方法[44],此項技術實現了便攜微型自動化處理[45],已廣泛的應用于食品安全檢測領域中。生物芯片的種類包括基因芯片、蛋白質芯片、組織芯片和細胞芯片等[46]。以蛋白質芯片為例,其檢測步驟如圖3,相比其他生物技術,生物芯片技術具有消耗試劑少、結果可比性高等特點[47]。郭志紅[48]運用蛋白芯片技術檢測了雞肉中鹽酸克侖特羅、恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶等的殘留,結果表明每種藥物在雞肉中的回收率均在60%～120%,變異系數在25%以內。

圖3 蛋白質芯片檢測流程圖Fig 3 Protein chip detection flowchart

4.4 生物傳感器檢測法 生物傳感器主要是由識別元件(如抗原抗體)和信號轉換器組成[49],可形象的如圖4所示。該法具有準確性高、處理時間短和成本低等特點,該技術在國外發展很快,基本已廣泛應用到各行各業中[50]。劉衛華[51]等運用氟苯尼考多克隆抗體成功構建了一種基于石墨烯-殼聚糖復合修飾材料的電化學免疫傳感器技術檢測雞肉、雞蛋中的氟苯尼考殘留,結果表明,每次的回收率均在76.90%～94.30%之間。由此可見,生物傳感器檢測法可應用于大批量的樣本檢測,且檢測的地域局限小。

圖4 生物傳感器檢測法原理圖Fig 4 Schematic diagram of biosensor detection method

5 展 望

獸藥殘留種類和途徑十分復雜,目前已廣泛應用于獸藥殘留檢測的技術中,不論是前處理技術,還是樣品的檢測技術,都存在著一些如儀器體積大,造價高,檢測地受限等缺點。我國雖已逐漸開始普及生態養殖,但現下這些綠色養殖法因成本、時間和技術等問題還未完全普及,應用并不廣泛。因此,規范養殖、嚴格按規定使用獸藥、加強市場監管和發展獸藥殘留檢測技術手段仍然十分重要。微型、高通量、低耗材、低成本的獸藥殘留快速檢測技術亟待完善,應用的領域也將更加廣泛。