雞傳染性支氣管炎病毒特異性單克隆抗體的制備與鑒定

薛 麒,侯力丹,黃小潔,秦義嫻,毛婭卿,孔冬妮,王 嘉,吳華偉,劉 丹

(中國獸醫藥品監察所,北京100081)

雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis)是一種由雞傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)引起的急性高度接觸性呼吸道疾病。該病常發生于雞或火雞,4周齡內的雛雞最易發病,死亡率可高達90%,給養雞業造成了巨大經濟損失[1-3]。我國IBV的主要流行毒株有呼吸型和腎型,由于IBV基因易發突變等因素給該病的防控帶來較大壓力[4-6]。IBV血清型眾多且不同血清型缺乏交叉保護,其中N 蛋白在病毒復制中起到重要作用,其編碼的基因序列是IBV進化最為保守的基因[7]。IB常規的檢測方法有病毒分離鑒定、血清學方法和分子生物學方法等,也是《中國獸藥典》規定必須檢測的外源病毒之一,通過雞胚接種,以雞胚死亡或感染發病作為判定依據作初步鑒定,也可用雞檢查法檢測IBV的抗體[8]。單克隆抗體技術已廣泛應用于禽源病毒的抗原變異分析和檢測方法建立[9-10],本研究旨在采用原核表達系統表達純化IBV N蛋白,并結合雜交瘤技術制備IBV特異性單克隆抗體,為雞傳染性支氣管炎病毒的檢測方法研究和生物學特性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、毒株和實驗動物 pET30a-N重組質粒,由中國獸醫藥品監察所構建及鑒定;IBV H120株、M41株等由中國獸醫藥品監察所制備和保存;8周齡BALB/c雌性小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑 表達菌株BL21購自北京全式金公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海百賽生物技術有限公司;Protein Marker、兔抗鼠IgG-HRP、一抗稀釋液、膜封閉液、HRP抗體稀釋液、增強型DAB顯色試劑盒、TBST均購自索萊寶生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純;HAT為Sigma公司產品。

1.3 N蛋白的原核表達及純化 將重組質粒pET30a-N轉化至BL21感受態細胞,挑取單克隆,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中,于37 ℃搖床培養過夜。將上述菌液以1∶100的比例再轉接含氨芐青霉素LB液體培養基培養至OD600 nm為0.6～0.8,加入IPTG誘導置37 ℃搖床200 r/min培養6 h。取誘導后的菌液進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.4 重組N蛋白的可溶性分析及純化 將活化的菌液加到含氨芐青霉素的LB液體培養基中,培養至OD600 nm為0.6～0.8,IPTG(0.5 mM)16 ℃誘導過夜。將誘導菌液、未誘導菌液、裂解菌液上清及沉淀分別進行SDS-PAGE電泳檢測。采用GST柱對重組N蛋白進行純化。

1.5 單克隆抗體的制備 按照常規方法進行小鼠免疫、細胞融合和雜交瘤細胞篩選。將純化后的N蛋白作為免疫原,于背部皮下多點注射免疫小鼠,每次免疫接種間隔2周,第3次免疫1周后采血,分離血清檢測ELISA抗體效價,第3次免疫后2周腹腔注射免疫原加強免疫1次。3 d后融合,于融合后第10 d取細胞培養上清進行陽性克隆篩選,分別以N蛋白和His蛋白作為包被抗原,通過間接ELISA方法進行篩選,共進行3次亞克隆。

1.6 單克隆抗體的鑒定

1.6.1 單克隆抗體的亞類鑒定 取經亞克隆定株后的雜交瘤細胞培養上清,根據小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書進行,測定單克隆抗體的亞類。

1.6.2 Western-blot檢測雜交瘤細胞 將滅活后的IBV H120株和M41株經處理后,進行SDS-PAGE電泳分離并轉至PVDF膜上;用適當稀釋的雜交瘤細胞上清作為一抗于室溫孵育1 h,用1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗于室溫孵育1 h并用增強型DAB顯色試劑盒進行顯色。

1.6.3 IFA方法檢測雜交瘤細胞 將IBV H120株、M41株以及IBDV、ILT、EDSV和ND等常見的禽類病毒以200EID50/0.1 mL接種CEK細胞培養5 d,經甲醇固定后,以雜交瘤細胞上清作為一抗于37 ℃孵育1 h,用FITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗于37 ℃孵育1 h,置于熒光顯微鏡下進行觀察,以評價單抗與IBV的反應性和單克隆抗體的特異性。

2 結果與分析

2.1 pET30a-N的誘導表達 取1 mL誘導表達的pET30a-N轉化至BL21的菌液進行SDS-PAGE,結果在45 kD處可見表達條帶,符合預期大小(圖1)。

M:蛋白分子質量標準;1:未誘導對照(pET30a-N轉化至BL21);2-3:IPTG誘導(pET30a-N轉化至BL21)M:Protein molecular weight Marker;1:No induced control(BL21);2-3:IPTG induced(BL21)圖1 pET30a-N誘導表達Fig 1 The induced expression of pET30a-N

2.2 重組蛋白的可溶性分析 超聲裂解誘導后的菌液,將菌液上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳,結果顯示,pET30a-N蛋白主要出現在沉淀中,表明該蛋白以包涵體形式表達(圖2)。

M:蛋白分子質量標準;1:超聲后全菌;2:超聲后沉淀;3:超聲后上清M:Protein molecular weight Marker;1:Total bacteria after ultrasound;2:Precipitation after ultrasound;3:Ultrasound supernatant圖2 pET30a-N重組蛋白可溶性分析Fig 2 Soluble analysis of pET30a-N recombinant protein

2.3 雜交瘤細胞篩選 將雜交瘤細胞培養上清用間接ELISA 方法在N蛋白和His蛋白包被板上進行ELISA抗體檢測,將3次篩選均顯示陽性的細胞株進行亞克隆及擴大培養定株。共篩選出3株ELISA陽性雜交瘤細胞株,分別命名為1#、18#、19#(表1)。

表1 雜交瘤細胞株的ELISA分析Tab 1 ELISA analysis of hybridoma cell lines

2.4 單克隆抗體的鑒定

2.4.1 亞類的鑒定 用ELISA方法對三株雜交瘤細胞進行鑒定,結果顯示1#、18#、19#重鏈類型均為IgG1,輕鏈類型均為Kappa(表2)。

表2 ELISA法測定單克隆抗體類及亞類Tab 2 Detection of subclasses of McAbs by ELISA

2.4.2 Western-blot檢測單克隆抗體 將滅活后的IBV H120株進行SDS-PAGE電泳分離,并轉至PVDF膜上,用3株單抗作為一抗,進行Western-blot鑒定,結果顯示3株單抗均與H120株產生特異性反應,在約52 kD大小處(N蛋白分子量)能特異性結合(圖3)。

M:蛋白分子質量標準;1:1#單克隆抗體;2:18#單克隆抗體;3:19#單克隆抗體M:Protein molecular weight Marker;1:1# monoclonal antibody;2:18# monoclonal antibody;3:19# monoclonal antibody圖3 Western-blot鑒定單克隆抗體Fig 3 Western-blot analysis of the monoclonal antibody

2.4.3 IFA方法檢測單克隆抗體 為獲得具有廣譜反應性的群特異性單克隆抗體,選取18#單克隆抗體,進行IFA方法檢測。結果顯示單克隆抗體僅與IBV H120株、M41株發生特異性反應,出現特異性綠色熒光,而與IBDV、ILT、EDSV和ND等常見的禽類病毒均不發生反應(圖4)。說明單克隆抗體的特異性良好。

3 討 論

雞傳染性支氣管炎是危害我國禽類的重大傳染病之一,其病毒傳染性強、變異性高、血清型和基因型復雜,感染雞不僅會出現各種呼吸系統的癥狀,也會影響雞產蛋地數量和質量,對家禽養殖業造成了嚴重的損失[11-13]。因此,建立有效的診斷和檢測方法對于更快的發現該病有著非常重要的意義。IBV有4種結構蛋白,其中N蛋白是4種結構蛋白中唯一位于病毒內部的結構蛋白,具有高度的保守性,且N蛋白能誘導機體產生免疫應答[14-15]。此外不同IBV毒株之間N蛋白具有高度的同源性。周景明等針對IBV的N蛋白利用細胞融合法制備篩選出了8株能與所有基因型IBV結合的單克隆抗體,并對其中1株純化與鑒定,具有良好的特異性和較高的親和力[16]。杜旭彬等同樣針對IBV的N蛋白制備并篩選出8株能與所有基因型IBV結合的單克隆抗體,單抗具有良好的廣譜性[17]。但周景明等與杜旭彬等僅用ELISA方法和Western-blot方法鑒定單克隆抗體,均沒有使用IFA方法鑒定單抗。IFA方法由于IBV不易適應體外細胞培養存在較大的難度。其病毒在傳代細胞系上需要連續數次傳代才能使其適應細胞生長,但大多數毒株可以在雞胚原代細胞(如CEF細胞、CEK細胞)上生長,然而僅在CEK細胞上會出現典型的細胞病變[18-19]。單克隆抗體技術廣泛地應用于病毒的基因、蛋白的結構和功能研究,在病毒的快速診斷和檢測中發揮了重要作用,開展IBV單克隆抗體研制十分必要。

N蛋白在宿主體內產生高水平的抗體,其抗體產生時間和免疫原性均優于其他蛋白,因此,本研究對IBV H120株編碼N蛋白的基因序列進行綜合性二級分析及抗原性分析,選擇親水性好且抗原性較好的41-391aa區域進行后期抗原制備。利用大腸桿菌感受態細胞(BL21)表達并純化IBV NP蛋白,多次免疫小鼠后進行細胞融合,采用ELISA方法和Western blot方法篩選出3株雜交瘤細胞株。可靠的篩選方法在制備單抗的過程中起到關鍵作用,ELISA方法篩選時選用表達NP蛋白和標簽蛋白His作為包被抗原,進行3輪雙篩選,此方法簡化了篩選過程并排除標簽蛋白在篩選過程中的干擾。3株單克隆抗體經Western-blot鑒定,能與常見基因型的IBV特異性結合。同時采用IFA方法檢測單抗的特異性,篩選出的3株單抗均與能H120毒株、H52毒株產生IFA反應,但1#和19#不與M41、疫苗株等產生IFA反應。18#單抗能與H120毒株、H52毒株M41、疫苗株等產生IFA反應,說明其具有廣譜的反應性。因此,后續可以選擇群特異性單克隆抗體18#,以期為IBV IFA快速檢測方法的建立打下基礎。該單克隆抗體僅與IBV發生特異性反應而與NDV、IBD、AIV等禽類常見病毒均無交叉反應。本研究成功制備了IBV單克隆抗體,為下一步開展IBV診斷試劑如IFA檢測試劑盒、ELISA檢測試劑盒等的研制和進行IBV生物學特性研究奠定了物質基礎。