衰老相關分泌表型相關的lncRNAs 模型預測肝細胞癌患者預后的構建和驗證

周丁杰 戈 偉 曹德東

武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢 430060

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是導致全球癌癥死亡的第四大原因[1]，每年造成80 多萬人死亡。HCC 患者的5 年生存率僅為5%～30%[2]。盡管目前靶向治療和免疫療法已進入臨床，但肝癌患者的預后仍然較差。尋找新的治療靶點及檢測預后生物標志物仍是當下研究的重點。衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）是指由衰老細胞分泌的細胞因子、生長因子和酶等分子，這些分子可引發(fā)慢性炎癥反應，促進腫瘤的形成和發(fā)展[3]。研究表明，SASP 在肝癌中的作用與其成分有關。例如，SASP 中的白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8 等因子被認為是肝癌的重要促進因子，能夠促進肝癌細胞的增殖和侵襲，抑制免疫系統(tǒng)的反應[4]；而轉化生長因子β 等因子則能夠促進肝癌干細胞的增殖和轉移[5]。在肝癌中，SASP 參與了腫瘤微環(huán)境的形成和轉化過程[6]，并且lncRNA 作為SASP 中的重要組成部分，也在肝癌中發(fā)揮了重要作用。研究顯示，GAS5 參與了肝癌中的SASP，可以通過抑制IL-6 的表達來抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，并提高肝癌患者的生存率[7]。另外，GAS5 還可以通過調(diào)節(jié)核因子-κB 信號通路來抑制肝癌細胞的轉移和侵襲[8]。lncRNA-H19 可以通過介導細胞內(nèi)活性氧水平的升高，促進IL-6 和IL-8 等SASP 相關因子的分泌，從而促進肝癌細胞的增殖和侵襲[9]。上述結果顯示，SASP 相關的lncRNA 有望成為肝癌診斷和治療的新靶點。基于SASP 相關的lncRNA，本研究建立了一個包含6個lncRNA 的風險模型，旨在優(yōu)化肝癌臨床治療，改善肝癌患者預后[9-16]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在癌癥基因組學圖譜（the cancer genome stlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫[10]中檢索并下載了424 例HCC 患者樣本的RNA 測序數(shù)據(jù)，臨床資料包括年齡、性別、生存時間、生存狀態(tài)、臨床分期及TNM 分期，排除有模糊值和臨床資料不完整以及隨訪時間＜30 d 的樣本后，最終納入241 例HCC 樣本。并按1∶1 的比率將納入樣本按計算機隨機分為實驗組（120 例）和驗證組（121例）。通過Ensembl 網(wǎng)站[11]（http://asia.ensem-bl.org/）對轉錄組數(shù)據(jù)注釋以區(qū)分mRNA 和lncRNA 數(shù)據(jù)，提取HCC 的lncRNA 表達矩陣。

1.2 實驗方法

1.2.1 差異表達基因及l(fā)ncRNA 的篩選 在GeneCards網(wǎng)站[12]（https://www.genecards.org/）中獲取相關系數(shù)＞7 的201 個SASP 基因，隨后利用R 軟件中的“l(fā)imma”包[13]對HCC 樣本和正常樣本中的SASP 相關基因進行差異分析，篩選標準為|logFC|≥1 且FDR＜0.05，得到差異基因。隨后設定相關系數(shù)為|r|＞0.4 且P＜0.001，對HCC 樣本中的lncRNAs 和差異基因進行Spearman 相關分析，獲取SASP 相關lncRNAs。

1.2.2 預后風險模型的建立 利用Perl 語言腳本將臨床數(shù)據(jù)和對應的lncRNA 矩陣樣本對應后合并。使用R 軟件中“survival”包（https://github.com/therneau/survival）對SASP 相關lncRNAs 進行單因素Cox 回歸分析，篩選出HCC 預后相關的lncRNAs。采用“glmnet”軟件包[14]進行的lasso 回歸分析對篩選出的lncRNA 進一步限制，采用十倍交叉驗證來獲得lambda 懲罰參數(shù)的理想值。經(jīng)過lasso 回歸解決共線性問題，再經(jīng)過多因素Cox 回歸分析后，將得到的lncRNAs 納入風險模型中。lncRNA 模型的計算公式為：風險得分=（coefi×xi）。系數(shù)值用“Coef”表示，所選lncRNAs 的表達值用“x”表示。

1.2.3 風險模型的評估 應用風險模型計算出每個HCC 患者的風險分數(shù)。根據(jù)風險評分的中位數(shù)，將HCC 患者分為低風險組和高風險組。對高風險組和低風險組用Kaplan-Meier 曲線評估生存差異，繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估風險模型靈敏度與特異度。單因素和多因素Cox回歸分析比較風險模型和其他臨床病理變量（年齡、性別、臨床分期、TNM 分期）的關系，運用R 軟件“ggpubr”包（https://rpkgs.datanovia.com/ggpubr/）繪制了不同臨床病理參數(shù)下的高、低風險組之間的生存差異。

1.2.4 風險模型的免疫圖譜分析 利用Perl 語言將矩陣與含風險值的樣本文件合并，得到高、低風險組中不同樣本基因的表達量新矩陣。使用“GSVA”工具[15]探索樣本的風險評分與樣本中免疫細胞浸潤和經(jīng)典的免疫檢查點相關標志物之間的關系。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有分析皆由R 軟件（4.1.3）和Perl 完成。散點圖展示樣本的風險評分與生存狀態(tài)的關系，生存曲線采用Kaplan-Meier（K-M）法生成，使用單因素和多因素Cox 比例風險回歸模型評估SASP 相關lncRNAs預后模型，采用ROC 曲線評價預測模型的可靠性和準確性。計量資料采用t 檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC 中SASP 相關差異表達基因（differential gene expression，DEGs）及l(fā)ncRNA 的篩選

本研究對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的HCC 隊列的RNA測序數(shù)據(jù)清洗后共納入241 例樣本。通過“l(fā)imma”包對HCC 樣本和正常樣本進行差異分析，得到58 個顯著差異的SASP 基因。其中有36 個上調(diào)基因及22 個下調(diào)基因（圖1A）。熱圖展示了所有的DEGs 在樣本中的表達情況（圖1B）。并利用Spearman 分析得到DEGs 的1 048 個lncRNAs。

圖1 腫瘤組織和正常組織間的DEGs 表達

2.2 構建lncRNA 風險模型

利用Perl 腳本從測序數(shù)據(jù)中分離出SASP 相關lncRNA 的表達矩陣，隨后聯(lián)合生存資料，利用單因素Cox 回歸分析確定了64 個預后相關且差異表達的lncRNAs（P＜0.001）。隨后對這些lncRNAs 進行了Lasso 回歸，得到14 個SASP 相關的lncRNAs（圖2A），通過10 輪交叉驗證確定了最佳懲罰參數(shù)值（圖2B）。最后通過多因素Cox 回歸分析，從上述14 個lncRNAs中篩選出6 個lncRNAs，包括AL031985.3、AC124067.4、AC009283.1、AC107021.2、LINC00324、HPN-AS1，構成風險模型。公式：風險評分=AL031985.3 expression×（0.768 307）+AC124067.4 expression×（0.301 32+AC009 283.1 expression×（-0.367 63）+AC107021.2 expression×（0.495 064）+LINC00324 expression×（-0.511 08）+HPNAS1 expression×（-0.751 87）。多因素Cox 回歸分析結果見表1。圖2C 展示了模型中6 個lncRNAs 在HCC樣本中的表達情況。本研究使用Cytoscape 來進一步可視化lncRNAs 和對應的mRNA 的關系（圖2D，|R2|＞0.4 和P＜0.001）。Sankey 圖顯示，AC009283.1、HPN-AS1 和LINC00324 是保護因素，而AC107021.2、AC124067.4 和AL031985.3 是風險因素（圖2E）。

表1 多因素Cox 回歸分析篩選用于構建預后風險模型的SASP 相關lncRNA

2.3 風險模型的評估

2.3.1 高、低風險組間的生存分析 生存分析結果顯示，HCC 患者的預后隨著風險值升高而惡化（圖3A）。K-M 曲線結果顯示，與高風險組比較，低風險組患者的預后更好（P＜0.001）（圖3B）。風險值ROC 曲線顯示，1、3、5 年生存率的曲線下面積（AUC）分別為0.812、0.754、0.739（圖3C）。

2.3.2 單因素和多因素Cox 回歸分析 為了進一步評估此風險模型在HCC 中的應用，本研究結合了其他病理參數(shù)，包括年齡、性別、臨床分期、TNM 分期，在實驗組和驗證組中分別進行單因素和多因素Cox 回歸分析。結果顯示，在實驗組中，風險評分的HR 在單變量Cox回歸分析中為1.437（95%CI：1.280，1.614）（圖4A，P＜0.001）。在多因素Cox 回歸分析中，HR 值為1.409（95%CI：1.242，1.599）（圖4B，P＜0.001）。在實驗隊列中，單變量、多變量Cox 的風險評分HR 值分別為1.372（95%CI：1.209，1.557）（圖4C，P＜0.001）和1.366（95%CI：1.178，1.585）（圖4D，P＜0.001），提示此風險模型可作為HCC 患者的獨立預后因素。