針刺調控腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區環狀RNA_009775 表達的研究

向 靜，江姍姍，唐 紅，汪紅娟，李展富，王 瑤，謝燦明，田浩梅，陳楚淘*

湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208

缺血性腦卒中是因腦動脈阻塞引發腦組織受損或死亡，造成相應功能障礙的一類臨床常見疾病。 高發病率、高致死率、高致殘率是此病的主要特征[1]，對家庭及社會造成了沉重的醫療負擔。 恢復局部血供是治療缺血性腦卒中最有效的手段，然而過程中存在再灌注引發局部損傷及中樞神經系統功能障礙加重的風險[2]。 血流的再通導致腦組織功能不可逆損傷的現象，被稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）[3]，減輕CIRI是缺血性腦卒中整體治療方案的重要組成部分。 針刺對CIRI 的療效已逐步被世界范圍內的臨床及基礎研究證實[4-6]，其機制與抑制炎癥級聯反應、減輕過度氧化損傷、調節細胞自噬等方面密切相關[7]，但其微觀層面的機制仍有待進一步挖掘。

隨著新一代測序技術的發展，非編碼RNA 對基因及蛋白質表達水平的關鍵調控作用引起人們的重視[8]。環狀RNA(circularRNA，circRNA)具有區別于其他非編碼RNA 的閉環結構，該結構可抵抗RNA外切核酸酶，相較于線性RNA 更穩定、更難以被降解。 此外，circRNA 可充當miRNA 結合位點的競爭性內源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA），間接影響miRNA 與下游mRNA 的結合，在調節基因表達中發揮重要作用[9]。 最近研究表明，相較于其他器官，circRNA 在大腦中高度富集[10]，可通過介導血管生成、神經炎癥、小膠質細胞活化和氧化應激等多種生物學途徑，參與中樞神經系統疾病的發生與進展[11-12]，提示circRNA 有望成為治療CIRI 的新靶點。 本研究擬采用基因芯片檢測技術，從circRNA 角度闡釋針刺抗CIRI 可能的作用機制，為治療CIRI 提供新的參考依據。

1 材料

1.1 實驗動物與分組

SPF 級雄性SD 大鼠39 只，體質量（230±20） g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。 所有大鼠飼養于SPF 級實驗動物室，室溫24～26 ℃，濕度40%～60%，通風，實驗期間自由攝水、進食，適應性飼養1 周。 依照隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、針刺組，每組13 只。實驗已通過湖南中醫藥大學實驗動物福利和倫理委員會審查，批準編號：LL2022030912。

1.2 主要試劑與儀器

8×15 K 規格circRNAs 芯片（美國Arraystar 公司，批號：R312-01）；circRNA 芯片標記試劑盒（美國Arraystar 公司，批號：Human CircRNA Array V2）；（0.32±0.2） mm 線栓（北京西濃科技有限公司，批號：2432-100）；0.25 mm×13 mm 針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司，批號：210501）；2%TTC 染液、4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3005、P1110）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2026）。掃描儀（美國Agilent 公司，型號：G250-5C）；恒溫水浴箱（常州金壇恒豐儀器制造有限公司，型號：HH-W600）。

2 方法

2.1 模型制備

模型組與針刺組采用改良版線栓法[13]制備CIRI模型。 大鼠術前禁食12 h，2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。以仰臥位固定大鼠于鼠板，局部消毒備皮，取頸正中線偏左側3 mm 行長約10 mm的縱向切口，鈍性剝離左側頸總動脈（common carotid artery, CCA）、頸內動脈（internal carotid artery, ICA）、頸外動脈與迷走神經；將線栓經CCA 緩送入ICA 以阻斷血流，當線栓黑色標記點處于CCA 分叉時固定線栓，消毒縫合切口，對留于切口外的線栓進行固定和標記。完成上述操作2 h 后，將線栓向外抽拉10 mm，實現缺血側的再灌注。 假手術組不插入線栓，其余操作與上述步驟相同。大鼠清醒后，采用Longa 5 分制評分法[13]對其進行評定，評分1～3 分者納入后續實驗，并對各組缺失大鼠以相同模型制備方法進行數量補齊。

2.2 分組及干預

待所有入組大鼠生命體征平穩（約模型制備后2 h），對其進行捆綁固定。 針刺組取穴參考大鼠穴位圖譜[14]，選取大椎、百會、水溝穴，大椎直刺3 mm，百會向后平刺2 mm，水溝朝鼻中隔方向斜刺2 mm，行平補平瀉捻轉手法1 min，頻率為90 次/min，間隔15 min 行針1 次，留針30 min；假手術組與模型組僅捆綁不針刺。 每12 h 干預1 次，共7 次。

2.3 神經功能缺損評估

分別于首次干預前、末次干預后，對3 組大鼠采用改良Garcia 評分法[15]綜合評估大鼠健側、患側比對運動、感覺及自主活動，總分18 分，分值愈低則提示神經功能缺損愈重。

2.4 TTC 染色法

結束末次Garcia 評分后，從每組隨機選取5 只大鼠取腦組織，經冷凍30 min 后制成約2 mm 厚的均勻切片，取相鄰5 個冠狀腦切片浸泡于2%TTC 染液的燒杯中，37 ℃恒溫水浴箱遮光孵育30 min，使其染色均勻。 完成染色后，將切片放入4%多聚甲醛固定24 h，觀察腦組織梗死情況，通過Image J 軟件量化腦梗死面積比。

2.5 篩選核心共同差異表達circRNA

從各組余下大鼠中，隨機選取3 只大鼠海馬組織，應用Nano Drop 測定評估所提取RNA 的純度和濃度，使用RNaseR 富集circRNA；隨機引物擴增并轉錄，樣本標記并雜交至微陣列載玻片，經孵育、洗滌、固定后，借助G2505C 掃描儀掃描分析切片。 通過Feature Extraction 軟件提取芯片數據，Gene Spring軟件將數據標準化，參照差異倍數（fold change, FC）＞1.25、P＜0.05 的標準，篩出差異表達circRNA；而后進行韋恩交集分析，選取針刺組/模型組、模型組/假手術組共同差異表達circRNA（common deferentially expressed circRNA, co-DEcircRNA）。

根據基因芯片表達譜及生物信息學分析結果，以FC＞1.25 和基因本體功能富集條目計數前2 為標準，篩選出核心co-DEcircRNA。

2.6 qRT-PCR 驗證

對基因芯片檢測后余下樣本進行核心co-DEcircRNA 表達水平驗證。 實驗過程嚴格按照試劑盒說明操作，選擇β-actin 作為內參基因，通過2-ΔΔCt法計算其表達量，各引物序列詳見表1。

表1 引物序列

2.7 構建circRNA-miRNA-mRNA 三元轉錄網絡

使用TargetScan 結合miRanda 軟件，以Seq Mirna Coverage＞0.3、CeMirna Coverage＞0.3、P＜0.05 為標準，預測與核心co-DEcircRNA 可能結合的miRNA及其下游靶基因mRNA，構建ceRNA 網絡，通過Cytoscape 3.10 軟件將網絡可視化呈現。

2.8 靶基因本體功能富集分析

利用在線數據庫（http://www.geneontology.org）對circRNA-miRNA-mRNA 網絡中的下游靶基因mRNA 進行本體功能富集分析。

2.9 Western blot 法

通過Western blot 法檢測海馬區神經元生物標記物神經元核抗原抗體（neuron specific nuclear protein, NEUN）相對表達量。 各組余下的5 只大鼠海馬組織加入蛋白提取液，勻漿及冰浴30 s/次，組織裂解后取上清液，BCA 蛋白定量檢測試劑盒進行目標蛋白定量。 將同等濃度的蛋白上樣，凝膠電泳使蛋白與樣本分離，并轉移至PVDF 膜，而后加一抗4 ℃孵育過夜，次日清洗后加二抗室溫下孵育1 h，使用化學發光檢測試劑盒進行可視化。 Image J 軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH作為參照計算NEUN 相對表達量。

2.10 統計學分析

數據通過SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。 符合正態分布的資料以“±s”表示，組內比較采用配對t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD 法，方差不齊者使用Tamhane's T2 法。 不符合正態性分布則以“M（Q）”進行描述，組內比較使用配對秩和檢驗，組間比較采用非參數檢驗。 均以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠干預前后Garcia 評分比較

干預前，與假手術組相比，模型組和針刺組Garcia評分明顯降低（P＜0.01）。 干預后，與假手術組相比，模型組評分明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組評分顯著升高（P＜0.01）。 干預后，針刺組Garcia 評分較干預前顯著升高（P＜0.01）。 詳見表2。

表2 各組大鼠干預前后Garcia 評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠干預前后Garcia 評分比較（分，±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與干預前比較，&&P＜0.01。

組別假手術組模型組針刺組n 13 13 13干預前18.00±0.00 9.85±1.95**11.54±1.66**干預后18.00±0.00 9.92±1.19**13.62±1.50##&&

3.2 各組大鼠缺血側梗死面積比比較

TTC 染色結果如圖1 所示，假手術組未見梗死區域；模型組、針刺組切片均呈現不同程度的梗死區域。 通過Image J 軟件與Swanson 法量化腦梗死面積比，相較于假手術組，其余兩組腦梗死面積比顯著升高（P＜0.01）；相較于模型組，針刺組腦梗死面積比顯著降低（P＜0.01）。 詳見表3。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色

表3 各組大鼠缺血側梗死面積比（%，±s）

表3 各組大鼠缺血側梗死面積比（%，±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別假手術組模型組針刺組n555腦梗死面積比0 24.14±4.97**15.01±2.50**##

3.3 各組大鼠缺血側海馬組織circRNA 差異表達譜及差異表達circRNA 數量

基于基因芯片檢測結果，根據FC＞1.25、P＜0.05的標準篩選組間差異表達circRNA，差異表達譜詳見圖2。 模型組與假手術組比較，差異表達circRNA為603 個；針刺組與模型組比較，差異表達circRNA為51 個。 模型組/假手術組、針刺組/模型組co-DEcircRNA 為23 個，在模型組中上調、針刺組下調的co-DEcircRNA 為7 個，在模型組中下調、針刺組上調的co-DEcircRNA 為16 個。 詳見圖3。

圖2 各組大鼠circRNA 差異表達譜

圖3 各組大鼠缺血側海馬組織差異表達circRNA 韋恩圖

3.4 核心co-DEcircRNA 的篩選

以P＜0.05、FC＞1.25 為標準，對co-DEcircRNA基因本體功能富集的條目進行計數，經篩選，circ_009775確定為核心co-DEcircRNA。 詳見表4。

3.5 qRT-PCR 驗證核心co-DEcircRNA 表達水平

與假手術組比較，模型組大鼠缺血側海馬區circ_009775 表達量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組circ_009775 表達量顯著上升（P＜0.01）。詳見表5。

表5 各組大鼠缺血側海馬組織circ_009775 表達水平的比較[M（Q）]

3.6 構建circRNA-miRNA-mRNA 三元轉錄網絡

采用TargetScan 與miRanda 軟件，預測與circ_009775 可結合的miRNA 以及下游靶基因mRNA，使用Cytoscape 3.10 軟件繪制構建了含有1 個circRNA、12 個miRNA、31 個mRNA 的三元轉錄網絡。詳見圖4。

圖4 circRNA-miRNA-mRNA 三元轉錄網絡

3.7 靶基因GO 功能富集分析

以P＜0.05 為標準，對31 個靶基因進行GO 功能富集分析，發現富集的生物進程主要為神經系統發育、神經元生成等；細胞成分主要為細胞質、細胞器、突觸等；分子功能主要為蛋白質結合、微管結合、酶結合等。 詳見圖5。

圖5 靶基因GO 功能富集分析

3.8 各組大鼠缺血側海馬區NEUN 表達比較

與假手術組比較，模型組大鼠缺血側海馬組織NEUN 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組NEUN 表達水平上調（P＜0.05）。 詳見表6、圖6。

圖6 各組大鼠缺血側海馬區NEUN 蛋白電泳圖

表6 各組大鼠缺血側海馬區NEUN 相對表達量的比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別假手術組模型組針刺組n555 NEUN/GAPDH 0.66±0.10 0.31±0.19**0.55±0.21#

4 討論

在全球范圍內，缺血性腦卒中占比腦卒中發病率的87%左右[1]，CIRI 通常繼發于缺血性腦卒中，是引起腦組織損傷與功能障礙進一步惡化的關鍵環節。盡管藥物與介入治療取得了一定成效，但仍存在治療窗口狹窄、增加出血風險性等局限性[16-17]。 這促使我們深入了解CIRI 的發生發展機制，尋找有效、安全的治療策略。 中醫學將CIRI 歸于“中風”范疇，多因風、火、痰、瘀等病邪上擾清竅，導致腦絡痹阻、神失其用，病位在腦。針刺作為治療“中風”的主要手段之一，已有數千年歷史。“病變在腦，首取督脈”，腦為元神之府，督脈入絡腦，大椎、百會、水溝皆屬督脈，三穴合用可調神導氣以醒腦開竅，是治療缺血性腦卒中的常用腧穴[18]。 課題組前期研究表明，針刺大椎、百會、水溝穴可緩減神經元超微結構的病理改變，促進神經元的修復，激活血管內皮生長因子，誘導血管新生，從而在一定程度上減輕CIRI[19]。本研究結果提示，針刺可改善CIRI 大鼠Garcia 神經功能評分、降低缺血側的腦梗死面積、促進神經元發育，這與先前研究報道一致[20]。

近年來研究發現，circRNA 在CIRI 發生與進展中均有異常表達，常通過ceRNA 機制途徑影響CIRI 進程[21]。CHEN 等[22]研究表明，circSHOC2 在體外氧-糖剝奪缺血模型與大腦中動脈閉塞小鼠模型中的過表達，可通過海綿miR-7670-3p 促進去乙酰化酶1 的表達，進而減輕缺血誘導的神經元凋亡。 此外，BAI等[23]通過基礎與臨床研究發現，circDLGAP4 作為內源性miR-143 海綿抑制其活性， 調節HECT-E3 型泛素連接酶的表達水平， 以減輕CIRI 對血腦屏障的損傷。 本研究中，通過芯片檢測技術發現3 組大鼠海馬區circRNA 表達的改變，其中23 個circRNA共同在模型組/假手術組、針刺組/模型組中發生了改變，提示針刺對CIRI 的治療機制可能與這類基因的表達變化相關。 而后qRT-PCR 法對篩選出的核心co-DEcircRNA 驗證結果顯示，circ_009775 的表達趨勢與芯片結果一致，提示針刺對circ_009775 的上調涉及抗CIRI 過程，是可能的治療靶點之一。為明確circ_009775 潛在的分子調控機制， 本研究預測并構建了circRNA-miRNA-mRNA三元轉錄網絡，對下游mRNA 的GO 功能富集結果顯示其與神經系統發育、神經元生成等生物進程密切相關。 良好的神經元發育是CIRI 后神經功能恢復的必要條件，本研究中對神經元生物標記物的檢測顯示， 針刺組NEUN 表達水平明顯高于模型組， 說明針刺具有一定的神經元保護作用，與上述GO 功能富集分析有一致的部分。

綜上所述，本研究從circRNA 的角度闡釋了針刺抗CIRI 的另一潛在效應機制，可能與激發多種ciriRNA 的改變有關，通過介導以circ_009775 為中心的circRNA-miRNA-mRNA 三元轉錄網絡，調控神經系統發育、神經元生成過程發揮其治療效應，從而改善CIRI 大鼠的神經功能缺損、縮小腦梗死面積、促進CIRI 海馬區的神經元修復，為揭示針刺多靶點、多途徑治療CIRI 的作用機制提供了理論依據。