當歸補血湯治療血管性癡呆作用機制網絡藥理學研究*

劉宗欣，李孟韓，萬 婷，陳興華△

（1. 廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405； 2. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

血管性癡呆（VD）是由腦血管病變導致慢性腦區低灌注引起的認知功能障礙綜合征，發病率高［1］，嚴重影響患者的生活質量。雖然控制致病性腦血管疾病危險因素、抗血小板聚集、抗凝等措施可預防VD［2］，但該病尚無獲批的特效治療藥物。VD 可由氧化應激、炎性反應、突觸改變及遺傳等多種因素導致［3］，其發病機制與神經元的自噬、變性、凋亡、壞死、氧化應激反應等有關，發病過程涉及磷脂酰肌醇- 3 - 激酶（PI3K）、核因子- κB（NF - κB）、細胞鐵死亡等信號通路［4-7］。有研究表明，細胞鐵死亡在認知障礙相關疾病的發病過程中有重要作用［8］。中醫認為，癡呆由髓減腦消、神機失用所致，其中氣血虧虛是主要病機。當歸補血湯是中醫經典補血方劑，始載于《陳素庵婦科補解》。該方劑治療認知障礙相關疾病療效明顯［9］，具有抗動脈粥樣硬化［10］、抗氧化［11］及神經保護作用［12］，其作用機制可能與氧化應激及細胞鐵死亡等相關。本研究中利用網絡藥理學及分子對接技術，探討了當歸補血湯治療VD 的作用機制，以期為VD患者的臨床用藥提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 當歸補血湯活性成分及靶點獲取

以“黃芪”“當歸”“huangqi”“danggui”為關鍵詞，檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）＞30%、藥物類藥性（DL）＞0.18 為條件篩選活性成分；通過TCMSP 數據庫獲取相關靶點，利用Uniprot 數據庫（https：// www. uniprot. org）查詢對應基因，采用Perl 5.26.3軟件對靶點基因進行注釋。

1.2 VD 靶點獲取

以“vascular dementia”為關鍵詞，分別檢索Gene-Cards數據庫（https：//genealacart.genecards.org）、OMIM數據庫（https：//www.omim.org），獲取VD 靶點基因，建立疾病基因數據集。

1.3 成分-共有靶點網絡構建

將成分靶點和疾病靶點導入R 3.6.1 軟件，獲得共有靶點。采用Perl 軟件對成分和共有靶點進行一一映射，利用Cytoscape 3.7.2 軟件對映射結果進行拓撲計算，構建成分- 共有靶點網絡。根據導出數據文件，對各成分與共有靶點的相互作用數量（即邊數）進行排序，篩選邊數＞15的成分為核心成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網絡構建

將共有靶點導入String 數據庫（https：//cn.stringdb. org），種屬選擇“homo sapiens”，最低相互作用閾值設為中等（medium confidence，0.400），隱藏游離節點，其他參數保持默認設置，構建PPI 網絡。導出.tsv 文件，采用R 3.6.1 軟件對節點、邊數、度值進行循環計算，以各條件均大于中位值的基因對應的蛋白為核心靶點。對核心靶點的度值排序，選取度值大于40 的靶點為關鍵靶點。

1.5 富集分析

將共有靶點輸入R3.6.1 軟件進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。利用Bioconductor 軟件包中的“org. Hs. eg. db”“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”繪圖包，設置P＜0.05，分別計算富集的基因數目，選取P值排名前20的GO 功能富集分析結果繪制柱狀圖；選取排名前30 的KEGG 通路富集分析結果繪制氣泡圖。

1.6 分子對接驗證

通過RCSB 數據庫（http：// www. rcsb. org）下載關鍵靶點結構，采用PyMOL 2.3.0 軟件去除蛋白結晶水、原始配體；根據核心成分小分子的CAS 號，從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下載SDF格式的3D 結構，導入ChemBio3D Ultra 14.0 軟件進行能量最小化，將Minimum RMS Gradient 設置為0.001，將小分子結構保存為.mol2格式。將處理后的關鍵靶點和核心成分文件分別導入AutoDock Tools 1.5.6軟件處理，將結果保存為pdbqt格式。采用POCASA 1.1在線工具（http：//altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）預測蛋白結合位點，采用AutoDock Vina 1.1.2 軟件進行分子對接，采用PyMOL 2.3.0 軟件分析相互作用模式，并計算結合能。

2 結果

2.1 當歸補血湯活性成分與靶點

共獲得活性成分22個（當歸2個，黃芪20個），詳見表1；作用靶點1 807 個（當歸864 個，黃芪943 個），剔除重復后為142個。VD靶點3 414個。

表1 當歸補血湯活性成分Tab.1 Active ingredients of Danggui Buxue Decoction

2.2 成分-共有靶點網絡

共獲得共有靶點81個（見圖1），成分-共有靶點網絡見圖2。共160個節點、354條邊。共獲得18個與VD有關的活性成分（黃芪16個、當歸2個），7個核心成分（3，9 -二-O-美迪紫檀苷、7-O-甲基異黏菌素醇、毛蕊異黃酮、芒柄花素、異鼠李素、山柰酚及槲皮素）。

圖1 藥物-疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease targets

2.3 PPI 網絡

PPI 網絡見圖3，共38 個節點，203 條邊，平均度值為5.01。共獲得絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、信號轉導與轉錄激活因子1（STAT1）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、白細胞介素4（IL - 4）、RELA 原癌基因、細胞間黏附分子1（ICAM1）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）10 個核心靶點，經度值篩選后，共獲得6 個關鍵靶點，即AKT1，HMOX1，MAPK8，MAPK14，PPARγ，STAT1。

圖3 當歸補血湯治療血管性癡呆共有靶點的蛋白相互作用網絡Fig.3 PPI network of common targets of Danggui Buxue Decoction in the treatment of VD

2.4 富集分析

GO功能富集分析獲得生物過程（BP）1 404個條目，細胞組成（CC）53 個條目，分子功能（MF）130 個條目。P值排名前20 的富集條目見圖4。其中，BP 主要包括異源性刺激應答、缺氧反應、血管管徑調節等；CC主要包括筏膜、突觸膜及其前后膜組成部分等；MF主要包括核受體活動、配體激活的轉錄因子活性、G蛋白耦聯胺類受體的活性等。KEGG通路富集分析共富集相關通路161條，排名前30的通路見圖5。主要涉及脂質和動脈粥樣硬化通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等。

圖4 GO功能富集分析結果Fig.4 Results of GO functional enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析結果Fig.5 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 分子對接

核心成分與關鍵靶點的對接結果見表2，將每個靶蛋白與活性成分結合性最強的對接結果（即芒柄花素與AKT1，槲皮素與HMOX1 和STAT1，異鼠李素與MAPK8，MAPK14，PPARγ）進行可視化，結果見圖6。

a. 芒柄花素與AKT1 b. 槲皮素與HMOX1 c. 槲皮素與STAT1 d. 異鼠李素與MAPK8 e. 異鼠李素與MAPK14 f. 異鼠李素與PPARγ圖6 分子對接示意圖a.Formononetin with AKT1 b.Quercetin with HMOX1 c.Quercetin with STAT1 d.Isorhamnetin with MAPK8 e.Isorhamnetin with MAPK14 f.Isorhamnetin with PPARγFig.6 Display of molecular docking

表2 分子對接結果（kcal/mol）Tab.2 Results of molecular docking（kcal/mol）

3 討論

VD 發病機制復雜，腦神經元的死亡與VD 的發生密不可分。VD 患者常存在慢性腦區低灌注損傷，引起腦細胞缺氧，從而導致氧化應激反應，同時產生大量自由基對腦血管造成損害，故氧化應激反應是造成VD 發病早期神經元死亡的重要原因［13］。鐵穩態失調、脂質過氧化和谷胱甘肽/ 谷胱甘肽過氧化物酶4 可能參與了VD的病理過程［14-15］。

當歸補血湯是傳統中醫藥學中的經典名方，其組方特色為黃芪與當歸用量比為5∶1，通過重用黃芪為君，少量當歸活血為臣，從而達到補益氣血的目的。本研究結果表明，當歸補血湯活性成分中，黃芪占多數，印證了該方配伍的合理性。中藥方劑包含多種藥物成分，每種成分可作用于多個靶點發揮藥效。本研究結果表明，當歸補血湯核心成分為7-O-甲基異黏菌素醇、毛蕊異黃酮、芒柄花素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素。其中，3，9-二-O-美迪紫檀苷是從黃芪中分離的小分子化合物，可抑制血小板衍生生長因子BB 誘導的細胞增殖及血管平滑肌細胞增殖［16］，防止動脈粥樣硬化及斑塊形成，從而預防VD發生，并延緩其進展；7-O-甲基異黏菌素醇有良好的OB，可能對心血管疾病、凝血障礙、帕金森病、神經膠質瘤等的治療具有潛在應用價值［17］。毛蕊異黃酮、芒柄花素及異鼠李素均被證實可通過激活Nrf2 通路或其上游靶點發揮抗氧化應激作用，從而保護損傷后的腦細胞［18-19］；槲皮素具有免疫調節、抗損傷、抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化等活性［20］，還可通過緩解腦部氧化應激反應改善缺血性腦卒中模型小鼠的腦功能［21］；山柰酚有助于保護大腦，預防缺血性腦卒中導致的腦損傷及其他慢性炎性疾病［22］。

本研究結果提示，當歸補血湯治療VD 的核心靶點與脂質和動脈硬化通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路、AGE - RAGE 信號通路、TNF 信號通路密切相關；且VD 的發病過程與能量代謝、炎癥相關等信號通路密不可分。低密度脂蛋白可積聚在血管壁內，并通過氧化修飾從而導致內皮功能紊亂，是導致動脈粥樣硬化及相關心腦血管疾病的根本原因；流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路可通過上調Nrf2的表達從而預防動脈粥樣硬化［23-24］。AGE/RAGE信號通路可提高NF-κB 的活性，從而促進白細胞介素1、白細胞介素6、TNF-α促炎性細胞因子的表達［25］。TNF信號通路可調節細胞凋亡、增殖及炎癥和免疫等生物過程，其受體可通過NF-κB和MAPK 途徑調控細胞生存及凋亡。故當歸補血湯的核心靶點可能參與腦血管動脈粥樣硬化形成的調控通路，可能通過調控NF - κB 和Nrf2 的表達對VD 起治療作用。當歸補血湯治療VD 的核心靶點與異源性刺激應答、缺氧反應、血管管徑調節等密切相關，提示當歸補血湯可能通過參與細胞缺氧反應、血管調節等過程發揮治療VD的作用。

本研究結果顯示，芒柄花素與AKT1，槲皮素與HMOX1 和STAT1，異鼠李素與MAPK8，MAPK14，PPARγ 均有較好的對接效果。AKT1 基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過胞內磷脂酰肌醇激酶依賴的機制被胞外信號激活，是PI3K/ AKT 信號通路的核心因子。YI等［26］的研究表明，PI3K-AKT-mTOR 通路的持續激活可抑制鐵死亡。芒柄花素與AKT1 結合良好，SUGIMOTO 等［27］研究發現，芒柄花素可通過激活PI3K/Akt-Nrf2信號增強抗氧化基因表達，降低活性氧水平，從而實現對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 的神經保護，故推測芒柄花素可能通過與AKT1 靶點結合從而發揮激活相關通路的作用。

STAT1 具有抑制細胞增殖、促進凋亡的作用［28］。研究證明，Nrf2 可通過JAK/ STAT 等潛在信號通路被激活［29］。HMOX1 基因是鐵死亡過程中的重要靶點基因，其編碼的蛋白是鐵死亡過程中鐵依賴性脂質過氧化的必需酶。YANG 等［30］通過腫瘤相關實驗表明，Nrf2/HMOX1 信號軸的激活可抑制細胞鐵死亡過程。TIAN等［31］的實驗證明，槲皮素能通過激活Nrf2 信號通路上調HMOX1 的表達，以保護內皮細胞免受氧化應激。LUO 等［32］的研究發現，槲皮素可通過HMOX1 誘導調節巨噬細胞中以還原型輔酶Ⅱ為來源的超氧陰離子的產生，且該過程與Nrf2 的核內積累和其負調控因子KEAP1 的下調有關。當歸補血湯能增加細胞的能量代謝，鐵是血紅蛋白攜氧必不可少的因素，其代謝過程發生異常會導致貧血。故槲皮素可能通過調控HMOX1 及STAT1靶點基因從而激活Nrf2通路，可能與細胞鐵死亡過程被抑制有關。

PPARγ 是一類由配體調節的核激素受體，主要負責脂類的分解代謝等［33］。MA 等［34］證明，藥物可通過調節腎炎模型小鼠Nrf2及PPARγ途徑發揮抗氧化和抗炎作用。MAPK8 與MAPK14 同為絲裂原活化蛋白激酶，是MAPK 通路的核心因子。MAPK 是細胞外信號從細胞表面傳導至細胞核內部的重要傳遞者，可被氧化應激反應及多種促炎因子激活，廣泛參與細胞內多種信號傳導過程，對Nrf2/HMOX1通路具有激活和調節作用［35］。LI 等［36］通過細胞實驗證明，藥物可通過靶向MAPK -Nrf2/ARE 信號通路，從而保護黑色素細胞免受氧化應激。但MULATI 等［37］通過動物實驗證明，異鼠李素通過抑制MAPK 信號通路改善了高脂肪和高果糖飲食模型小鼠的認知障礙，提示MAPK通路在調節氧化應激過程中可能發揮雙向作用。WU 等［38］的研究發現，異鼠李素可通過Nrf2/ HMOX1 信號通路緩解高糖缺氧HT22 海馬神經元的炎性反應。根據分子對接結果，推測異鼠李素可能通過MAPK 與PPARγ 共同調節Nrf2 信號通路，從而緩解細胞氧化應激反應。

綜上所述，當歸補血湯活性成分可能作用于多個VD 靶點相關通路，調控氧化應激損傷機制或鐵死亡各個環節，從而緩解或逆轉受損細胞的氧化應激過程。