黏膜相關淋巴組織結外邊緣區淋巴瘤錯配修復蛋白和微衛星表型檢測的臨床意義

王紅霞, 江亞軍, 陳 軍, 李 靜, 盧國豐, 楊 榮

(1. 上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院病理科,上海 201800; 2. 上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院血液科,上海 201800)

錯配修復(mismatch repair, MMR)蛋白糾正DNA復制時出現的堿基錯配,其缺失會引起基因水平的微衛星不穩定(microsatellite instability, MSI)。微衛星插入或突變可能導致對細胞生長和凋亡起重要調節功能的基因失活,進而促進腫瘤的發生發展[1]。目前MMR蛋白與微衛星表型檢測在結直腸癌中應用較多,給患者提供治療和預后信息,但在惰性淋巴瘤中的研究較少。本研究旨在探索黏膜相關淋巴組織結外邊緣區(extranodal marginal zone of mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤中MMR蛋白表達和微衛星表型檢測的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年7月—2021年5月于上海健康醫學院附屬嘉定區中心醫院病理科存檔的40例MALT淋巴瘤作實驗組,男20例,女20例;年齡41-87歲,中位年齡69.5歲,發病部位包括15例胃,3例腸,3例眼瞼,2例涎腺,1例甲狀腺,睪丸及附睪各1例,其他黏膜及軟組織14例。收集同期良性淋巴組織增生20例作對照組,男11例,女9例,年齡35-81歲,中位年齡59歲,8例腸,6例胃,咽扁桃體環3例,皮膚1例,軟組織1例,脾臟1例。病理診斷根據2017版造血與淋巴組織腫瘤WHO分類標準進行復核診斷。本研究實驗組的診斷主要依據典型的組織學形態如中心樣細胞,單核樣B或小淋巴細胞單克隆性增生、淋巴上皮病變、濾泡植入及免疫表型的排他性診斷,部分病例經上級醫院會診行Ig基因重排檢測。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法 應用EnVision快捷兩步法檢測兩組MMR蛋白的表達,MLH1、MSH2、MSH6、PMS2鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司,4種MMR蛋白均定位于細胞核,著棕黃色。

1.2.2 免疫組化結果判讀 參考文獻[2],按照染色強度計為3種結果: (-),MMR蛋白缺失;(+-++),MMR蛋白強弱不等陽性;(+++),MMR蛋白強陽性。按照4種MMR蛋白表達結果分為3種模式: Ⅰ型任意1個MMR蛋白的缺失;Ⅱ型任意1個MMR蛋白呈強弱不等的陽性;Ⅲ型MMR蛋白均質強陽性。按照淋巴濾泡內MMR蛋白的免疫形態分為2型: A型存在淋巴濾泡內MMR蛋白斑駁陽性;B型淋巴濾泡內MMR蛋白強陽性。淋巴濾泡的定位參考CD21的免疫形態,腫瘤性淋巴濾泡植入的判斷參考丁向東等[3]的研究,反應性增生型濾泡樹突網完整,周界清晰,網格規則無破壞;腫瘤型濾泡樹突網有不同程度的破壞,周界不清,網格破碎。

1.2.3 多重熒光PCR-毛細管電泳法 MSI檢測試劑盒購于桐樹基因,檢測位點為BAT25、BAT26、D5S346、D2S123、D17S250。在石蠟包埋組織的腫瘤和瘤旁組織分別提取DNA,然后進行PCR擴增,毛細管電泳測擴增產物,檢測實驗組中微衛星表型,具體實驗流程參考試劑說明書。

1.2.4 微衛星檢測結果判讀 在5個檢測位點中: (1) 2個或2個以上位點有改變確定為高頻率MSI(microsatellite instability-high, MSI-H);(2) 有1個位點改變確定為低頻率MSI(microsatellite instability-low, MSI-L);(3) 沒有改變則稱為微衛星穩定(microsatellite stability, MSS)。Bat-25和Bat-26熒光標記TAMRA黑色,D17S250和D5S346熒光標記FAM藍色,D2S123熒光標記HEX綠色。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析,采用四格表χ2檢驗和行×列χ2檢驗分別比較率和構成比差異,采用McNemar配對χ2檢驗比較兩種實驗方法檢測結果的差異。檢驗水準α取0.05,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MMR蛋白在兩組淋巴濾泡外的表達差異

4個MMR蛋白在實驗組表達構成比差異有統計學意義(χ2=25.92,P<0.05),與MLH1[0(-),18(+-++),22(+++)],MSH2[0(-),24(+-++),16(+++)],PMS2[1(-),18(+-++),21(+++)]相比,MSH6[3(-),32(+-++),5(+++)]在實驗組缺失率[7.5%(-)]和強弱不等表達率[80%(+-++)]最高,差異趨勢最顯著。MMR蛋白在實驗組有3例(7.5%)部分缺失,2例為MSH6缺失,1例為MSH6和PMS2共同缺失;在對照組有1例PMS2缺失5%(1/20),兩組間MMR蛋白缺失率的差異未見統計學意義(P>0.05)。實驗組錯配修復蛋白表達模式,Ⅰ型3例(7.5%),Ⅱ型32例(80%),Ⅲ型5例(12.5%);對照組中Ⅰ型1例(5%),Ⅱ型19例(95%),Ⅲ型0例(0%)。兩組間錯配修復蛋白表達模式構成比差異未見統計學意義(P>0.05),Ⅱ型表達模式在實驗組(80%)和對照組(95%)均易見。見圖1A-圖1D。

圖1 MSH6在兩組的表達模式及在兩組淋巴濾泡內的免疫形態差異

2.2 MMR蛋白在兩組淋巴濾泡內的表達差異

MMR蛋白在兩組淋巴濾泡內的免疫形態如下: MLH1,45%A型+55%B型、MSH2,60%A型+40%B型、MSH6,87.5%A型+12.5%B型、PMS2,47.5%A型+52.5%B型;對照組均為100%B型,兩組間淋巴濾泡內MMR蛋白免疫形態差異均見統計學意義(P<0.05)。實驗組內與MLH1(45%),MSH2(60%),PMS2(47.5%)比較,MSH6(87.5%)的A型占比最高,差異具統計學意義(P<0.05)。MSH6在87.5%實驗組存在淋巴濾泡內斑駁陽性(A型),對照組未見此現象(0%),借助CD21定位淋巴濾泡,有助于判斷腫瘤性淋巴濾泡。見表1、圖1E-圖1H。

表1 MMR蛋白在兩組淋巴濾泡內的免疫形態差異

2.3 微衛星表型與MMR蛋白檢測結果分析

40例MALT淋巴瘤中,35例(87.5%)檢測結果為微衛星穩定(MSS),1例(2.5%)為MSI-L,4例(10%)為MSI-H。1例MSI-L為D2S123位點不相同;4例MSI-H包括3例D5S346和D2S123位點不相同,1例Bat-25和Bat-26位點不相同。5例MSI中有2例MSI-H為MSH6缺失,余3例MSI未出現MMR蛋白缺失。35例MSS中有1例為MSH6和PMS2共同缺失,余34例MSS未出現MMR蛋白缺失。見表2、圖2。

圖2 MSI-H,在腫瘤和瘤旁組織D5S346和D2S123位點不同(箭頭)

表2 微衛星狀態與MMR蛋白檢測結果的分析

參考黎相照等[4]的研究結果,將MSI-H或MMR蛋白表達缺失計作陽性檢測結果,PCR-毛細管電泳法檢測的MSI-H率(10%,4/40)高于免疫組化檢測MMR缺失的檢出率(7.5%,3/40),但配對χ2檢驗兩種方法檢測結果差異未見統計學意義(P>0.05),見表3。PCR-毛細管電泳法檢測微衛星狀態和免疫組化檢測MMR蛋白的檢出率一致性達到92.5%(37/40),包括34例MSS/MMR蛋白未缺失,2例MSI-H/MMR蛋白缺失,1例MSH-L/MMR蛋白未缺失;不一致率達7.5%(3/40),包括2例MSI-H(MMR蛋白未缺失),1例MSS(MSH6和PMS2蛋白缺失)。

表3 PCR-毛細管電泳法和免疫組化法檢測結果分析

3 討 論

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2是4種重要的錯配修復蛋白,MSH2和MSH6形成二聚體識別DNA的錯配,MLH1和PMS2形成二聚體修復錯配的堿基[5]。研究報道結直腸癌[6]、乳腺癌[7-8]、子宮內膜樣癌[9]、甲狀腺癌[10]等實體腫瘤均有低頻率的MMR蛋白缺失,其在淋巴瘤中的研究較少。MSI是因DNA錯配修復系統缺陷而引起的微衛星片段出現堿基對插入或丟失的現象,參與部分腫瘤的發生發展。MSI-H或MMR蛋白缺失是2017年被FDA批準適用于多種惡性腫瘤檢測的生物標志物,這部分患者不僅對免疫治療具有良好的反應,還對化療具有增敏反應,對評估預后亦有一定的臨床價值[6-11]。MALT淋巴瘤屬于惰性淋巴瘤,治療包括觀察等待、放化療、免疫治療等,但約20%-25%MALT淋巴瘤遠處浸潤,2%-15%發生骨髓累及,少數可轉化為侵襲性淋巴瘤或繼發第二原發惡性腫瘤,對于復發/難治性患者尚未達成共識[12]。因此研究MALT淋巴瘤中MMR蛋白和微衛星狀態可能具有一定的臨床意義。

羅春英等[13]研究發現,在42例B細胞非霍奇金惡性淋巴瘤中,MSH2和MLH1的蛋白缺失率分別為33.33%(13/42),38.10%(16/42)。Degroote等[2]研究報道,18%(5/28)的胃MALT淋巴瘤檢出了MSI,5例MSI均有MSH6蛋白缺失,1例MSI-H顯示了彌漫性大B細胞淋巴瘤轉化特征,因而認為MMR蛋白缺失可能參與了胃MALT淋巴瘤的發生發展。本研究MALT淋巴瘤MMR蛋白的缺失率為7.5%(3/40),2例MSH6缺失,1例MSH6和PMS2共同缺失,其低頻缺失的臨床意義與在結直腸癌中是否一致呢?有研究揭示MSH6蛋白可通過維持基因組穩定性來保護B淋巴細胞免受腫瘤轉化,而人類MMR蛋白缺失易患結腸和造血系統惡性腫瘤,小鼠MSH6缺失主要導致B細胞淋巴瘤[14]。一項關于MSI-H的實體瘤大樣本(1 057例)研究發現MSH6基因突變最常見(25.7%),且具有組織學特異性,并與腫瘤突變負荷相關[15]。上述研究提示與MLH1、MSH2、PMS2相比,MSH6可能更密切地參與淋巴瘤的發生發展、MSI和腫瘤突變負荷的調控。MMR蛋白在MALT淋巴瘤低頻缺失,發揮相對穩定的錯配修復作用,可能源于如下兩個原因: (1) MALT淋巴瘤不同于一般的實體瘤,除外內源性的DNA損傷和基因突變,發生在體細胞超突變和抗體類別轉換過程中產生的dU∶dG錯配是需要MMR蛋白來糾正的,這對于淋巴細胞的發育和成熟是必要的。(2) 從生物學行為層面分析,MALT淋巴瘤屬于惰性淋巴瘤,細胞成熟程度及其功能更接近于其起源細胞,低頻率的MMR蛋白缺失有利于保證其正常的修復功能。

MMR蛋白缺失和MSI檢測在結直腸癌中應用較多,這部分患者有獨特的臨床病理特征,預后優于MMR蛋白未缺失和MSS患者,對化療更敏感[4,11,16]。黎相照等[4]應用免疫組化和PCR-毛細管電泳法檢測結直腸癌組織中MMR蛋白缺失和MSI的一致性為98.7%。有關淋巴造血系統腫瘤微衛星狀態的研究較少[16-17],在20例成人T細胞白血病/淋巴瘤中MSI有4例(20%)、92例彌漫性大B細胞淋巴瘤中MSI有12例(13.1%,3例為MSI-H,9例為MSI-L)、1 394例急性髓系白血病中未檢測到MSI(0%)。本研究40例MALT淋巴瘤中檢測到5例MSI(4例MSI-H,1例MSI-L)。將MSI-H和MMR蛋白缺失判作陽性,MSI-H表型檢出率為10%(4/40),MMR蛋白缺失率為7.5%(3/40),兩種方法檢測結果的一致性達92.5%(37/40),略低于黎相照等[4]在結直腸癌中98.7%的一致性研究結果。MSI-H還可能與MALT淋巴瘤細胞的侵襲性生物學行為相關。Degroote等[2]的研究中提到1例胃MSI-H的MALT淋巴瘤患者呈現彌漫性大B細胞淋巴瘤轉化的特征。筆者認為,檢測MALT淋巴瘤MMR蛋白缺失和MSI在指導復發難治的患者或發生侵襲性淋巴瘤轉化的患者選擇免疫治療方案、預測侵襲性淋巴瘤轉化風險等方面可能具有潛在的臨床意義,有待進一步研究證實。

本研究還觀察到一個有趣的現象: MSH6在實驗組淋巴濾泡中的表達模式不同于對照組。MSH6在實驗組表達與MLH1、MSH2、PMS2不同,缺失率和強弱不等表達率最高,筆者選擇性觀察MSH6在兩組的免疫形態差異。MSH6在兩組淋巴濾泡內表達分為兩型: A型,淋巴濾泡內見錯配修復蛋白斑駁陽性;B型,淋巴濾泡內見錯配修復蛋白強陽性。實驗組A型35例(87.5%),B型5例(12.5%);對照組A型0例(0%),B型20例(100%),兩組間MSH6免疫形態比較差異有統計學意義。淋巴結及獲得性淋巴組織的生發中心是B淋巴細胞輸出的場所,細胞增殖活性強,DNA復制頻率高,為了保證DNA復制的保真性、穩定性,配套的錯配修復系統功能隨之增強。這就解釋了對照組生發中心的淋巴細胞MMR蛋白均質強陽性的現象。當淋巴濾泡邊緣區來源的細胞發生瘤變時,腫瘤細胞逐步往生發中心侵襲,發生了濾泡植入。強弱不等陽性或陰性的腫瘤細胞植入正常淋巴濾泡生發中心時,免疫形態則表現為殘余正常生發中心細胞強陽性,植入腫瘤細胞強弱不等陽性或陰性,最終呈現為實驗組淋巴濾泡內存在斑駁陽性模式。MSH6在腫瘤性淋巴濾泡內斑駁陽性的免疫形態很好地解釋了MALT淋巴瘤的濾泡植入過程,反映了腫瘤侵犯的現象,有助于良惡性淋巴濾泡的鑒別。

綜上所述,雖然MALT淋巴瘤僅檢測到低頻率的MSI-H表型和MMR蛋白缺失,但在指導復發難治的患者或發生侵襲性淋巴瘤轉化的患者選擇免疫治療方案、預測侵襲性淋巴瘤轉化風險等方面可能具有潛在的臨床意義。MSH6在MALT淋巴瘤的淋巴濾泡內存在高頻斑駁陽性的免疫形態,可輔助鑒別腫瘤性淋巴濾泡。