芪歸多糖的分離純化及體外抑制腫瘤細胞增殖研究

劉文娟,馬善波,鹿紋菲,崔東曉,徐頂巧,樂世俊,曹 蔚,唐于平*

1陜西中醫藥大學 陜西中醫藥管理局中藥配伍重點研究室,咸陽 712046;2空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科,西安 710032;3西北農林科技大學化學與藥學院,楊凌 712100

黃芪-當歸配伍是臨床最常用、最具代表性的補氣養血藥對。在中醫方劑數據庫中,黃芪與當歸配伍的頻次高達2 632次[1]。黃芪和當歸以5∶1配伍形成當歸補血湯,是一首補氣生血的傳世名方,因其組方精煉、療效確切而廣受中醫藥研究學者青睞。芪歸藥對又可作為基礎藥對配伍組方,黃芪當歸建中湯、補中益氣湯、歸脾湯、圣愈湯、補陽還五湯等方中無不用芪歸藥對組方,臨床應用及研究多圍繞該藥對展開。現代藥理學研究表明:芪歸藥對具有促進造血、免疫調節、心血管保護、抗腫瘤等作用[2,3]。芪歸藥對抗腫瘤作用明顯,對結腸癌[4]、肺癌[5]、白血病[6]等都表現出顯著的抑制作用。

多糖在芪歸藥對中含量豐富,為黃芪和當歸所共有的大分子類活性成分,具有改善貧血、抗衰老、抗纖維化、抗腫瘤等作用。多糖是芪歸藥對發揮補血功效的重要活性成分,與非多糖組分相比,當歸補血湯多糖組分的補血作用更強,能顯著促進血虛小鼠骨髓造血、加快血細胞的分化與成熟、增加外周血紅細胞數目,且當歸多糖補血活性尤為顯著[7,8]。芪歸多糖還可增強免疫和抗氧化功能,調節衰老細胞周期、端粒酶活性延緩細胞衰老,減輕衰老模型小鼠腎組織氧化損傷[9]。此外,芪歸多糖對CCl4誘導的肝纖維化損傷、環磷酰胺引起的脾和胸腺損傷具有保護作用[10]。多糖是芪歸藥對發揮抗腫瘤作用的主要藥效物質之一,組成芪歸藥對的黃芪、當歸單味藥多糖對多種腫瘤具有顯著抑制作用。黃芪多糖對肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等作用顯著,能通過直接抑制腫瘤細胞增殖,誘導凋亡和周期阻滯、激活免疫系統、調節炎癥微環境發揮抗腫瘤作用[11]。當歸多糖對白血病、黑色素瘤、結腸癌、肝癌等作用突出,能通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、增強免疫、調節自噬、抑制腫瘤細胞侵襲和遷移等方式發揮抗腫瘤作用[12-14]。國內外學者對組成芪歸藥對的單味藥黃芪、當歸中多糖結構進行了廣泛深入的研究。目前已從黃芪中分離獲得34種均一多糖,從當歸中分離獲得均一多糖39種,這些多糖的一級結構包括分子量、單糖組成、糖殘基組成、糖苷鍵的構型及連接順序等均進行了解析[11,14]。但目前對芪歸多糖的研究多涉及提取工藝的優化,芪歸均一多糖的相關研究報道甚少,對于芪歸藥對多糖的抗腫瘤活性還未進行系統研究。芪歸藥對中是否具有顯著腫瘤細胞增殖抑制作用的新型結構多糖,還未見報道。結合前期研究基礎和相關文獻報道,本研究從芪歸藥對中分離獲得6種芪歸多糖,并選擇了單味藥當歸多糖或黃芪多糖對其具有顯著抑制作用的人結腸癌細胞HCT116、肺癌細胞A549和白血病細胞K562,考察了芪歸多糖對3種腫瘤細胞的增殖抑制作用和凋亡誘導作用,發現2種芪歸多糖能顯著抑制HCT116細胞和A549細胞增殖并誘導其凋亡,為具有潛在抗腫瘤活性均一多糖,本研究為基于“芪歸多糖”及“黃芪-當歸藥對”的健康產品研發與進一步應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

人結腸癌細胞株HCT116、白血病細胞株K562和肺癌細胞株A549為本室傳代保株。無水乙醇、氯仿、正丁醇、過氧化氫、氯化鈉、硝酸鈉(均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司);DMEM/1640基礎培養基(貨號:C11995500BT,賽默飛世爾科技公司);胎牛血清(貨號:10100147,美國Gibco公司);CCK-8試劑盒(貨號:C0039,碧云天生物技術有限公司);Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號:FXP0211-100,四正柏生物技術有限公司);100×青-鏈霉素混合液(貨號:P1400,索萊寶生物技術有限公司);胰蛋白酶-EDTA(貨號:T1300,索萊寶生物技術有限公司)。

紅外光譜儀(TENSOR 27,布魯克科技有限公司);高效液相色譜儀(Ultimate 3000,賽默飛世爾科技有限公司);流式細胞分析儀(FACS Calibur,BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 芪歸總多糖的提取

稱取黃芪飲片4.0 kg,酒當歸飲片1.0 kg混勻;加入4倍體積無水乙醇回流3次,除去脂質類雜質;揮發去除乙醇,加入去離子水至6倍體積,待飲片吸水完全,80 ℃煎煮2次,每次1 h;合并煎煮液,濃縮、離心取上清,加入4倍體積無水乙醇沉淀,4 ℃靜置過夜,離心收集沉淀,復溶于水,獲得芪歸粗多糖。用Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)結合反復凍融除去蛋白質類雜質;以多糖∶水∶過氧化氫=10∶1∶0.5混勻,pH=7,70 ℃氧化脫色3 h;濃縮,離心收集上清,透析48 h,收集袋內液,為芪歸總多糖(polysaccharides from Astragali Radix-Angelica Sinensis Radix,AAPS)。

1.2.2 AAPS的分離和純化

利用DEAE Sephadex A-25離子交換柱,以梯度NaCl溶液(0、0.5、1.0、2.0 mol/L)洗脫,將總多糖分為4個亞組分(AAPS-1、AAPS-2、AAPS-3和AAPS-4);利用Sephadex G-100尺寸排阻柱,以0.1 M的NaCl溶液洗脫,對4個亞組分進一步分離純化,得到6種芪歸均一多糖,分別命名為AAPS-1a、AAPS-1b、AAPS-2a、AAPS-2b、AAPS-3a和AAPS-4a。

1.2.3 均一性和相對分子量的測定

系列標準葡聚糖(Dextran T-10、T-50、T-120、T-50、T-150和T-410)及樣品臨用前溶解于0.1 mol/L NaNO3中,終濃度為1 mg/mL,高速離心后,取200 μL采用凝膠色譜-示差-多角度激光光散射系統進行分析,色譜柱:TSK-GEL G2500 PWXL柱(TOSOH,7.8 mm×30.0 cm)或 TSK-GEL G4000 PWXL柱(TOSOH,7.8 mm×30.0 cm);進樣量10 μL,流動相0.05 mol/L Na2SO4水溶液,流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃,等度洗脫100 min。根據公式Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)計算各葡聚糖標準品的分配系數值Kav,并以Kav為橫坐標,以標準葡聚糖分子量(Mw)的對數(lgMw)為縱坐標,繪制標準曲線(Ve表示各標準葡聚糖的洗脫體積;Vo為根據藍色葡聚糖確定的空體積,Vt為根據葡萄糖確定的總體積);樣品同法制備,進樣10 μL;根據得到的Ve值計算其分子量大小。

1.2.4 FT-IR分析

分別稱取多糖2 mg,與干燥KBr研磨混勻,壓片,紅外光譜儀測定4 000～400 cm-1的紅外光譜,確定糖分子中主要官能團和吡喃糖的糖苷鍵構型。

1.2.5 細胞培養

選取人結腸癌細胞株HCT116、白血病細胞株K562和肺癌細胞株A549,分別給予含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養液,5% CO2、37 ℃條件下培養箱中培養。

1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖

取對數生長期HCT116、K562和A549細胞,分別以5×103個/孔接種于96孔板。待細胞過夜貼壁,給予終濃度為0、0.1～100 μg/mL的芪歸多糖溶液培養48 h,每組設8個復孔,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h,酶標儀490 nm測吸光度值(A),實驗重復3次。按照下列公式計算細胞抑制率:細胞抑制率=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%,以對數藥物濃度lg C(C:給藥濃度,μg/mL)為橫坐標,抑制率為縱坐標繪制增殖抑制曲線。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞,分別以1×105個/mL的密度接種于六孔板中,每孔3 mL,細胞過夜貼壁后,分別加入終濃度為50 μg/mL的AAPS-1a或AAPS-3a,對照組只加培養液,每組設4個復孔。培養48 h后,收集細胞,預冷的PBS清洗細胞2次。結合緩沖液重懸細胞,調整細胞密度為1×106～5×106個/mL,分別取100 μL細胞懸液用于周期和凋亡測定。加入Annexin V/FITC 5 μL,室溫避光孵育5 min;加入PI染液10 μL,PBS 400 μL,立刻進行流式檢測。

1.2.8 統計分析

數據表示為平均值±標準誤,并采用方差分析(ANOVA)或t檢驗(Student′st-test)進行顯著性分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 芪歸均一多糖的提取分離和純化

如圖1所示,芪歸總多糖(AAPS)經DEAE-Sephadex A-25離子交換柱分離,用梯度NaCl洗脫獲得4個亞組分AAPS-1、AAPS-2、AAPS-3和AAPS-4。各亞組分進一步經Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱分離和純化,以0.1 mol/L NaCl洗脫,苯酚-硫酸法測定糖含量,收集含糖組分,分別命名為AAPS-1a、AAPS-1b、AAPS-2a、AAPS-2b、AAPS-3a和AAPS-4a,得率分別為18.7%、15.5%、21.2%、13.8%、9.1%和10.8%。

圖1 芪歸多糖的分離純化流程

2.2 芪歸總多糖的腫瘤細胞增殖抑制活性評價

為了初步明確芪歸多糖是否具有腫瘤細胞增殖抑制作用,及其對不同腫瘤細胞的增殖抑制活性,首先測定了芪歸總多糖(AAPS)對人結腸癌細胞HCT116、肺癌細胞A549和白血病細胞K562增殖的影響(見圖2)。AAPS均能劑量依賴性抑制3種腫瘤細胞的增殖,同等濃度最大抑制率分別為65.7%、33.4%、22.4%,對HCT116細胞增殖抑制作用最強,IC50值為(66.51±2.2)μg/mL。同等濃度作用條件下,當歸總多糖(polysaccharides from Angelica Sinensis Radix,ASPS)和黃芪總多糖(polysaccharides from Astragali Radix,ARPS)對HCT116細胞最大抑制率分別為28.7%、49.6%,抑制作用弱于AAPS。

圖2 當歸總多糖、黃芪總多糖和芪歸總多糖對腸癌細胞HCT116增殖的抑制作用

該結果提示,芪歸總多糖AAPS中含有具有顯著抗結腸癌活性的均一多糖組分。因此,需要對AAPS進一步分離純化獲得的芪歸均一多糖進行腫瘤細胞增殖抑制活性測定,以篩選獲得活性組分。

2.3 6種芪歸均一多糖對人結腸癌細胞HCT116增殖抑制作用評價

評價AAPS分離純化后獲得的6種芪歸均一多糖對HCT116、A549、K562增殖的影響(見圖3)。6種芪歸均一多糖中,AAPS-1a和AAPS-3a對HCT116增殖抑制作用最強,同等濃度最大抑制率分別為82.8%和94.1%,IC50值分別為(47.59±1.3)μg/mL和(18.33±2.5)μg/mL;對A549增值抑制作用次之,同等濃度最大抑制率分別為74.4%和81.8%,IC50值分別為(52.12±1.1)μg/mL和(170.21±2.3)μg/mL;對K562的抑制作用最弱,最大抑制率分別為45.4%和36.4%。結果表明,芪歸均一多糖AAPS-1a和AAPS-3a對HCT116和A549細胞具有明顯的增殖抑制作用,且對HCT116的抑制作用最強,為潛在的抗結腸癌活性均一多糖。

圖3 6種芪歸均一多糖對HCT116、A549和K562的增殖抑制作用

2.4 AAPS-1a和AAPS-3a對正常人腸上皮細胞HIEC增殖活性的影響

明確芪歸均一多糖AAPS-1a和AAPS-3a對HCT116細胞的顯著增殖抑制后,研究進一步測定了芪歸總多糖AAPS和AAPS-1a、AAPS-3a對人腸上皮細胞HIEC增殖的影響,結果如圖4所示:測定濃度范圍內,AAPS、AAPS-1a和AAPS-3a均對HIEC細胞毒性較小,最大抑制率分別為17.62%、15.63%和24.25%,顯著低于對3種腫瘤細胞的抑制。以上結果表明,AAPS-1a和AAPS-3a對腫瘤細胞的增殖抑制作用有一定特異性。

圖4 AAPS、AAPS-1a和AAPS-3a對人腸上皮細胞HIEC增殖的抑制作用

2.5 AAPS-1a和AAPS-3a顯著誘導HCT116細胞凋亡

確定了AAPS-1a和AAPS-3a的結腸癌細胞增殖抑制作用后,進一步測定了其對3種腫瘤細胞凋亡的影響(見圖5)。AAPS-1a和AAPS-3a能顯著誘導HCT116細胞和A549細胞發生凋亡,分別給予AAPS-1a或AAPS-3a,HCT116凋亡率分別為31.4%和46.5%;A549凋亡率分別為19.3%和33.0%。此外,AAPS-1a和AAPS-3a對K562細胞凋亡無顯著影響,給予AAPS-1a或AAPS-3a后凋亡率分別為5.6%和6.0%,與正常組相比無顯著差異。以上結果表明,芪歸均一多糖AAPS-1a和AAPS-3a通過誘導凋亡對結腸癌和肺癌發揮體外抗腫瘤作用。

圖5 AAPS-1a和AAPS-3a對HCT116、A549和K562凋亡的影響

2.6 AAPS-1a和AAPS-3a的純度和分子量測定

HPSEC法測定了AAPS-1a和AAPS-3a的純度和分子量。結果如圖6A所示,AAPS-1a和AAPS-3a的HPSEC圖譜中信號峰均呈單一對稱性,說明AAPS-1a和AAPS-3a為均一性多糖;結合由系列葡聚糖(T-1、T-5、T-12、T-50、T-150、T-410)的保留時間與其各自分子量的對數繪制的校準曲線(見圖6B),計算得到AAPS-1a和AAPS-3a的分子量分別為7.3×105、8.5×104Da。

圖6 AAPS-1a和AAPS-3a的純度和分子量測定

2.7 AAPS-1a和AAPS-3a的FT-IR分析

采用FT-IR對AAPS-1a和AAPS-3a的結構進行初步分析,2種多糖的FT-IR圖譜均顯示多糖分子和基團的特征信號(見圖7)。其中,3 393 cm-1處的信號為O-H伸縮振動,2 929 cm-1和1 422 cm-1處信號為C-H拉伸振動和彎曲振動,1 356 cm-1處信號為多糖的環外C-O伸縮振動,1 652 cm-1附近信號為含有結合水的多糖產生的O-H變形振動。此外,還觀察到1 015、1 279和1 156 cm-1處的信號,對應于吡喃糖的C-O彎曲振動。

圖7 AAPS-1a和AAPS-3a的FT-IR圖譜

3 討論與結論

多糖由多個單糖單元通過糖苷鍵連接而成,是自然界最豐富、最重要的生物聚合物之一[15]。自1969年Nature雜志首次報道香菇多糖的抗腫瘤作用以來[16],多糖作為藥物的研究和應用引起了國內外學者的廣泛關注。中藥多糖在免疫調節、抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗病毒、心血管保護和神經保護活性等方面具有突出的藥理活性,是近年來中藥活性成分研究領域的熱點[17]。目前,已從靈芝[18]、人參[19]、黃芪[11]、當歸[14]、枸杞[20]等中藥中獲得數百種具有顯著藥理作用且純度較高的“活性多糖”。

與單味藥多糖相比,復方多糖可結合各單味藥多糖的生物活性,起到協同增效的作用。此外,復方多糖受到藥材來源、炮制技術、配伍效應、提取方式的影響,其純度和結構特征與單味藥多糖有所不同,如何在單味藥多糖研究的基礎上有效、充分地分離純化中藥復方多糖,并闡明其結構基礎和作用機制,是近年來中藥藥效物質研究的熱點與難點之一[21]。從中藥復方如四君子湯中獲得的均一多糖結構與單味藥多糖有所不同[22]。研究發現,芪歸藥對多糖具有明顯抗腫瘤活性[23],但芪歸多糖抗腫瘤的結構基礎和作用機制尚不清楚,芪歸藥對中多糖類成分的結構和活性與單味藥相比是否有所不同,還尚未見報道。本研究從芪歸藥對中分離得到芪歸總多糖(AAPS),對其進行腫瘤細胞增殖抑制活性篩選發現AAPS對結腸癌細胞增殖抑制作用顯著。對AAPS進行進一步分離純化后,發現其中兩種芪歸多糖AAPS-1a和AAPS-3a能顯著抑制人結腸癌細胞HCT116和肺癌細胞A549增殖,并誘導其凋亡。結構分析初步表明,AAPS-1a和AAPS-3a的分子量分別為7.3×105、8.5×104Da的芪歸均一多糖。綜上所述,AAPS-1a和AAPS-3a為具有潛在抗腫瘤作用的活性芪歸均一多糖。本研究為后續的芪歸多糖抗腫瘤物質基礎和構效關系研究提供研究基礎,為中藥復方大分子物質基礎研究提供重要方法、思路和實驗依據。