辣木葉多糖對小鼠潰瘍性結腸炎的防治與機制研究

Hosameldeen Mohamed Husien,彭偉龍,劉明江,伯若楠,李金貴*

1揚州大學獸醫學院;2江蘇省高校動物重要疫病與人畜共患病防控協同中心,揚州 225009;3布爾塔那大學獸醫學院,Rufaa 999129

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因極其復雜的非特異性、復發性結腸炎癥疾病,常導致患者結腸黏膜潰瘍和潰爛,出現頻繁的腹痛、腹瀉、便血等一系列臨床癥狀[1],因其反復發作,遷延難愈,嚴重影響了患者的正常生活,并且還會增加病人繼發感染和患結腸癌的風險。Eric等[2]研究表明,UC發病機制與腸屏障功能的受損和腸道微環境的改變密切相關。當腸黏膜屏障受損時,腸道固有層中的免疫細胞暴露在外界抗原和病原體中,激活的免疫細胞在機體內產生炎癥級聯反應,引起T細胞亞群介導非特異性Th2免疫反應[3],同時TLR4與銜接蛋白MyD88進行信號傳導,導致NF-κB的激活,促進白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子的表達[4],破壞腸道免疫穩態,進一步損傷腸腔上皮細胞。同時,腸道菌群的組成對免疫系統發育和功能具有重要影響[5],當腸道內有益菌群和致病菌群數量比例失調時,導致毒素、腸腔細菌和抗原進入機體,加劇UC患者腸黏膜炎癥和過度的氧化應激反應[6]。這提示針對炎性因子和腸道菌群進行干預是防治UC的有效靶點。

辣木(Moringaoleifera),原產于印度,其廣泛種植于非洲、亞洲的熱帶和亞熱帶地區[7],近年來大面積種植于我國的云南廣西地區,于2012年被中國衛生部批準認定為新資源食品,也是我國重要的藥食兩用的食品資源。辣木葉的營養價值極高,長期服用辣木葉食品可以提高人體免疫力,同時具有一定疾病預防的作用[8]。其主要的生物活性成分為多酚、黃酮和多糖類物質,并發揮著顯著的抗炎[9]、抗氧化和抗腫瘤作用。目前國內外對辣木葉多糖(Moringaoleiferaleaf polysaccharide,MOLP)的相關報道較少,還局限于傳統提取工藝的優化和化學組成分析,關于MOLP對腸炎的防治效果尚不明確。因此,本試驗采用DSS誘導建立UC小鼠模型,觀察MOLP對急性結腸炎小鼠體內炎癥反應和腸道菌群的改善效果,旨在明確MOLP對UC防治作用機制,以期為MOLP的藥理學研究和臨床疾病治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重為(20±2) g的SPF級雄性BALB/c小鼠50只,購于揚州大學比較醫學中心,實驗動物生產許可證號為SCXK[蘇]2017-0009,實驗動物使用許可證號為SYXK[蘇]2017-0044,合格證編號為NO.202206249,動物飼養于SPF級動物飼養室,飼養環境溫度為(24±2) ℃,相對濕度為(60±10) %,12 h明暗循環。試驗過程中小鼠均飼喂商品鼠糧,自由采食與飲水,實驗程序符合揚州大學獸醫學院實驗動物倫理委員會的批準(編號YZUDWLL-202206-008)。

1.2 藥物與試劑

辣木葉(云南孺子牛生物科技有限公司,Lot NO:210523);DSS(MW:36 000-50 000,美國MP Biomedicals公司,Lot NO:S6132);HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,Cat NO:G1120);RNA-easy isolation Reagent、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(Lot NO:11141ES60) 和ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司,Lot NO:11201ES08);透析袋(上海源葉生物科技有限公司,Cat NO:SP132594)髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所,Cat NO:A044-1-1);IL-1β(Cat NO:ck-E20174)、IL-10(Cat NO:ck-E20162)、TNF-α(Cat NO:ck-E20852)、HMGB1(Cat NO:ck-E20318) ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司);抗體TLR4(14358s)、MyD88(4283s)、P-IκBα(2859s)、IκBα(4812s)、P-p65(3033s)、p65(8242s)、β-actin(4970s)(Cell Signaling Technology公司);FITC標記羊抗兔(A0562)和Cy3標記的山羊抗兔二抗(A0516)(北京碧云天生物技術有限公司)。

1.3 主要儀器

RM2125RTS石蠟切片機(Leica公司);DM正置熒光顯微鏡(Leica公司);熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司);恒溫金屬浴(卡尤迪生物科技有限公司);ChemiScope化學發光成像系統(上海勤翔科學儀器有限公司);超純水系統(Merck Millipore公司);Epoch酶標儀(Biotak公司)。

1.4 方法

1.4.1 MOLP的制備

辣木葉按照Sharma等[10]研究報道的方法,將新鮮辣木葉超微粉碎后,在70 ℃條件下加去離子水以1∶10的比例提取辣木葉粗多糖三次,每次90 min,經4 000 r/min離心20 min,將上清液合并后經旋轉蒸發儀減壓濃縮至50 mL。隨后用300 mL 95%乙醇沉淀多糖,并在4 ℃條件下靜置過夜,將沉淀復溶于去離子水中,裝入透析袋(截止分子量3 500 Da)中4 ℃透析2 d后使用Sevage法(Sevage試劑∶多糖水溶液=1∶4)除去蛋白,重復萃取10次直至茚三酮反應為陰性,最后冷凍干燥得到MOLP。經苯酚-硫酸法測得糖含量為64.8%。

1.4.2 動物分組、造模及給藥

50只小鼠預飼養3 d后,稱重并隨機分成正常對照組(Con組)、模型對照組(DSS組)、MOLP 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg組(MOLP-L、MOLP-M、MOLP-H組)。除Con組飲用蒸餾水外,其余各組均飲用4% DSS(W/V)溶液7 d,建立小鼠UC模型。藥物處理組自造模第一天開始給予相應藥液進行灌胃,每只0.2 mL/d,連續給藥7 d。

1.4.3 小鼠一般狀況及疾病活動指數(DAI)評分

每天觀察記錄小鼠的體質量、糞便隱血情況和糞便狀態等一般狀況,參照Coope等[11]介紹的方法進行DAI評分,詳細DAI評分細則見表1,計算公式為:DAI=(體質量下降率+糞便性狀得分+糞便隱血得分)/3,體質量下降率=(每日體質量-初始體質量)/初始體質量×100%;使用聯苯胺冰醋酸法檢測糞便是否隱血或帶血,當DAI評分達到0.5分以上時表示小鼠UC模型造模成功。

表1 疾病活動指數評分標準

1.4.4 樣本采集

試驗結束后,將小鼠通過異氟烷進行麻醉,從小鼠眼眶靜脈叢采集血液于1.5 mL EP管中,3 000 r/min 離心10 min,吸取血清冷貯,用于后續ELISA試驗。待完全麻醉后用脫頸椎的方式處死小鼠,剖開腹腔,剪取距肛門1 cm處帶有回盲瓣的結腸,拍照觀察結腸長度;剪取距肛門1 cm處結腸組織約2 cm于4% 多聚甲醛中固定,用于后續HE染色和免疫熒光試驗;取Con、DSS、MOLP-H組小鼠結腸內的糞便至凍存管中,待提取糞便中細菌的DNA,以供腸道菌群檢測;剩余各組結腸組織置于凍存管中,液氮保存,用于后續qPCR以及蛋白相關檢測試驗。

1.4.5 HE染色觀察結腸組織病理學變化及病理損傷評分

取4% 多聚甲醛溶液中固定的結腸組織經脫水處理、透明、石蠟包埋、修蠟及切片等步驟經HE染色后置于顯微鏡下觀察結腸組織病理形態學變化并拍照,參照Cai等[12]方法進行病理損傷評分,標準如下:(1)炎癥嚴重程度:0分=無;1分=輕度;2分=中度;3分=重度。(2)損傷深度計分:0分=無;1分=黏膜;2分=黏膜及黏膜下層;3分=全層。(3)隱窩損傷評分:0分=無;1分=1/3基底部隱窩破壞;2分=2/3基底部隱窩破壞;3分=隱窩消失但上皮存在;4分=隱窩及上皮全部破壞。

1.4.6 血清中炎性因子的檢測以及結腸組織中MPO含量測定

采用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10和HMGB1的含量,使用MPO試劑盒檢測各組小鼠結腸組織中MPO含量。

1.4.7 結腸組織中炎性因子的mRNA表達水平

取凍存的小鼠結腸組織100 mg于EP管中,按照RNA提取試劑盒說明書的方法提取RNA,然后將其反轉錄成cDNA后,進行熒光定量PCR擴增,引物序列見表2。按照熒光定量試劑盒說明書預混20 μL反應體系,反應程序:95 ℃ 2 min預變性;95 ℃變性10 s,58 ℃反應30 s,進行40個循環;然后95 ℃反應15 s,60 ℃反應1 min,95 ℃反應15 s。該實驗用β-actin為內參基因,采用2-△△Ct法對Ct值進行相對定量分析。

表2 qPCR引物序列

1.4.8 Western blot法檢測結腸組織NF-κB信號通路相關蛋白表達情況

將100 mg凍存的結腸組織剪碎研磨后加入RIPA裂解液充分裂解,離心收集上清液,進行BCA蛋白濃度測定,然后將蛋白稀釋至相同濃度后置于沸水中煮沸10 min使蛋白變性。每個樣品取10 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳,電轉至PVDF膜后使用5%脫脂奶封閉2 h,隨后分別使用TLR4、MyD88、P-IκBα、IκBα、P-p65、p65、β-actin抗體(稀釋比例均為1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫孵育2 h,經TBST洗膜三次后使用ECL顯影儀檢測蛋白表達情況。以β-actin為內參,利用Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.4.9 鼠糞便中細菌DNA的提取及測序

采用CTAB方法對各組小鼠結腸內容物樣本的基因組DNA進行提取,利用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測DNA提取純度和濃度,隨后根據測序區域的選擇,針對16S rRNA基因V4-V5可變區合成特異性引物并對引物進行PCR擴增。PCR擴增產物檢測合格后,對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物,然后進行文庫構建。構建好的文庫經過Qubit和qPCR定量,文庫合格后,使用NovaSeq6000進行上機測序。

1.4.10 數據統計學分析

采用GraphPad Prism′s one-way ANOVA檢測進行統計分析,試驗結果均用平均值±標準誤表示,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MOLP對UC小鼠一般狀況以及DAI評分的影響

Con組小鼠的飲食和狀態正常,體重穩定增長,糞便呈麥粒狀,DAI評分為0。DSS組小鼠在第3～4 d開始出現被毛粗亂、精神狀態變差、體重下降、糞便黏稠并且出現輕微糊肛現象;第5～7 d糞便帶血嚴重、肛門處糞便黏連、畏寒、體重下降,結腸長度和DAI評分與Con組相比顯著升高(P<0.001)。各用藥組腹瀉和血便情況明顯減輕,精神狀態得到改善,體重有不同程度的增長,MOLP-M與MOLP-H組結腸長度和DAI評分與DSS組相比均顯著降低(P<0.001),詳見表3。

表3 各組小鼠平均體重變化率、疾病活動指數和結腸長度

2.2 MOLP對UC小鼠結腸組織病變及其形態結構的影響

圖1A為小鼠結腸HE染色100×所顯示圖片,來觀察小鼠結腸組織學改變情況。Con組的小鼠腸腺結構正常,杯狀細胞數量多,隱窩完整、排列有序;DSS組小鼠黏膜下層明顯水腫(黑色箭頭所示位置),腸隱窩結構被破壞、變形、排序紊亂(※所示位置),黏膜層和黏膜下層有大量炎性細胞浸潤,少數可達肌層(紅色箭頭所示位置);各劑量MOLP組能夠改善炎癥引起的組織學改變,但MOLP-L和MOLP-M組小鼠的結腸仍可見多處炎性細胞浸潤,隱窩結構被破壞,MOLP-H組改善效果最為明顯,腸絨毛形態完整,腺體層次清晰可見,潰瘍癥狀減輕。

圖1 各組小鼠結腸組織病理學觀察

病理損傷評分情況:與Con組相比,DSS組小鼠結腸組織病理損傷評分顯著升高(P<0.001);相比于DSS組,經MOLP處理后小鼠的結腸損傷狀況得到明顯改善,MOLP-M和MOLP-H組小鼠結腸損傷評分顯著降低(P<0.001)。

2.3 MOLP對UC小鼠血清中炎性因子和結腸組織MPO含量的影響

如表4所示,與Con組相比,DSS組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和組織中MPO含量顯著上升(P<0.001),IL-10含量顯著降低(P<0.001);與DSS組相比,MOLP處理組炎性因子和MPO的含量得到改善,尤其是MOLP-H組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和組織中MPO含量相比于DSS組均顯著下降(P<0.001),IL-10含量顯著上升(P<0.001)。

表4 各組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1和結腸組織MPO水平

2.4 MOLP對UC小鼠結腸組織炎性因子mRNA表達量的影響

DSS組小鼠結腸組織中促炎因子IL-1β、TNF-α、HMGB1的mRNA表達量與Con組相比均顯著增加(P<0.001),抗炎因子IL-10的mRNA表達量則顯著降低(P<0.001);使用MOLP干預后,IL-1β、TNF-α、HMGB1的mRNA表達量明顯降低,IL-10的mRNA表達量也有升高,且隨著MOLP劑量的增加,作用效果更顯著,與DSS組相比具有顯著差異(P<0.1,P<0.01,P<0.001)(見表5)。

表5 各組小鼠結腸組織IL-1β、TNF-α、IL-10、HMGB1 mRNA表達量

2.5 MOLP對UC小鼠結腸組織中NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與Con組相比較,DSS組小鼠結腸組織中P65和IκBα的磷酸化增多并且p-P65/P65和p-IκBα/IκBα的比值顯著增加(P<0.001),TLR4、MyD88蛋白表達量也顯著上升(P<0.001)(見表6);與DSS組相比較,MOLP-M和MOLP-H組均能明顯下調TLR4、MyD88蛋白的表達(P<0.1,P<0.001),其中MOLP-H組還可以顯著下調p-P65/P65和p-IκBα/IκBα蛋白的比值(P<0.1)(見圖2)。

圖2 各組小鼠結腸組織TLR4、MyD88、P65、p-P65、IκBα、p-IκBα蛋白表達

表6 各組小鼠TLR4、MyD88、p-P65/P65和p-IκBα/IκBα蛋白表達量

2.6 小鼠結腸糞便16S rRNA測序及多樣性分析

稀釋曲線可以直接反映測序數據量的合理性并反映樣本中物種的豐富程度,當曲線趨于平坦時,說明測序數據量漸進合理(見圖3A)。采用Venn圖分析OTUs(operational taxonomic unit)數量及不同組之間共有或特有的OTUs數量,Con組、DSS組和MOLP組特有OTUs分別為935、296、430個,總OTUs分別為3 109、2 628、2 714個,共有OTUs為1 526個,占總OTUs的18.06%。與Con組相比,DSS組小鼠腸道菌群物種豐度降低,經MOLP處理后豐富度有所改善(見圖3B)。以Observed species和Shannon指數分析組間物種多樣性差異是否顯著,結果顯示,DSS組Observed species和Shannon指數與Con組相比顯著降低(P<0.05,P<0.01),經MOLP處理后則明顯升高(P<0.1,P<0.001)(見圖3C、3D)。

圖3 各組小鼠腸道菌群多樣性分析

選取在門(Phylum)水平上最大豐度排名前十的各組小鼠腸道菌群結構組成進行分析發現,DSS組彎曲菌門(Campylobacterota)相對豐度(10.49%)高于Con組(2.69%),經MOLP處理后則明顯降低(5.58%);擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度經MOLP處理后(48.05%)比DSS組(51.79%)低且接近于Con組(44.94%);而MOLP組厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度(25.58%)明顯高于Con組(17.51%)和DSS組(16.49%)(見圖3E)。

在目(Order)水平分析各組小鼠的腸道菌群結構,擬桿菌目(Bacteroidales)的相對豐度最高,DSS組為50.76%,MOLP組與Con組接近,分別為46.39%和43.18%;彎曲菌目(Campylobacterales)的相對豐度在各組中占比趨勢與擬桿菌目相似,經MOLP處理后(5.85%)相比于DSS組有所降低(10.49%),接近于Con組(2.69%);同時毛螺菌目(Lachnospirales)相對豐度(9.27%)明顯高于Con組(4.58%)和DSS組(6.49%)(見圖3F)。

3 討論與結論

近年來,UC在全世界的發病率呈現逐年升高的趨勢,相比于歐洲國家,中國的UC發病率增長更快。現代醫學在臨床治療過程中多用糖皮質激素、水楊酸制劑和免疫抑制劑來對UC進行干預治療[13],但停藥后易復發和嚴重的藥物副作用使其成為醫學界棘手的問題。隨著臨床應用的不斷深入,純天然來源的植物多糖以其安全性、可及性、抗炎活性和高效的免疫增強功效受到關注[14]。辣木葉多糖作為辣木葉中有效活性成分之一,對它的功能活性研究主要集中在降血脂、降血糖、抗腫瘤和抗氧化[15]等方面,為了探究MOLP對腸炎的防治作用,本試驗應用DSS建立UC模型并予以治療。結果顯示,造模后小鼠出現腹瀉、血便、體重下降等癥狀,DAI評分升高,結腸長度變短等現象,提示造模成功,效果較為明顯。經MOLP處理后可以顯著改善UC小鼠的體重下降情況,降低DAI評分,減輕結腸黏膜受損和炎性浸潤,下調小鼠血清和結腸中促炎因子IL-1β、TNF-α、HMGB1的水平,上調抗炎因子IL-10的水平,同時抑制P65和IκBα的磷酸化,防止TLR4/NF-κB信號通路的過度激活,維持腸道菌群穩態,通過抑制機體炎癥反應和調節小鼠腸道菌群結構來發揮對UC的防治作用。

炎性細胞因子在UC發生發展過程中是不可缺少的一部分,它由免疫細胞產生,通過免疫細胞間的相關作用,刺激抗原特異性效應細胞的增殖以及介導局部和全身炎癥[16]。正常情況下,巨噬細胞對炎癥信號應答較弱,在免疫抑制的細胞中較少促進其產生[17],然而在UC發病期間,活化的巨噬細胞和樹突狀細胞分泌各種細胞因子如TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-10等用于調控炎癥反應,這些細胞因子濃度的上調或者過度激活都會導致T細胞失調和Treg/Th1、Th2、Th17失衡[18],促進中性粒細胞在炎性部位的積累,減少上皮細胞中電解質的分泌,增加膜的通透性,進一步加劇炎癥反應。用于治療UC的藥物和天然產物可有效的緩解炎性因子濃度和表達水平的失調,Xiao等[19]研究發現苦豆子總堿可通過調節UC小鼠體內促炎因子IL-1β、IL-23、IL-17水平,升高抗炎因子IL-10水平來緩解炎癥。本研究通過對UC小鼠血清中IL-1β、TNF-α、HMGB1和IL-10的檢測發現,MOLP可以明顯抑制促炎因子的表達,上調抗炎因子的水平,同時通過實時熒光定量PCR技術對組織炎性因子的檢測結果顯示,MOLP還可有效緩解UC小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α、HMGB1 mRNA的表達,增加IL-10 mRNA的表達。此外MPO是中性粒細胞的特征性酶,由中性粒細胞或某些組織的巨噬細胞分泌的血紅蛋白酶,是血紅素過氧化物酶家族成員[20],我們可以通過檢測小鼠結腸組織中MPO的活性來評判組織中中性粒細胞的浸潤程度。結果顯示MOLP可以顯著抑制UC小鼠MPO的活性,減少中性粒細胞在結腸組織中的數量。上述炎性因子的生成和MPO活性的升高與TLR4/NF-κB信號通路的核心地位密不可分,TLR4在天然免疫中識別病原微生物和控制獲得性免疫反應中起著重要的作用[21],當TLR4被激活后由銜接蛋白MyD88進行信號轉導,誘導IκB磷酸化并泛素化和降解,釋放NFκB p50/p65二聚體[22],活化的二聚體進入細胞核,立即啟動多種細胞因子的轉錄,導致IL-1β、TNF-α等數量增加,使炎癥持續并不斷擴大。Zhang等[23]發現UC小鼠結腸部位NF-κB信號通路被過度激活,靶向抑制NF-κB信號通路激活的治療方法來緩解UC是有效的。本研究發現,相比于Con組,DSS組小鼠結腸組織MPO活性明顯升高,TLR4、MyD88蛋白表達顯著增加,p-P65和p-IκBα蛋白上調,p-P65/P65和p-IκBα/IκBα的比值也隨之增加,使用MOLP處理后上述異常表達情況得到有效抑制,這提示MOLP可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的過度激活從而抑制炎癥因子的異常表達來發揮對UC的防治作用。

在正常情況下,腸道具有完善的屏障功能,腸道菌群同腸上皮層、黏液層、腸道淋巴系統一起構成腸黏膜機械、化學和生物屏障[24],能防止腸腔內致病性抗原侵入機體,維持機體正常運行,當腸道發生炎癥時,腸道菌群失調,腸屏障被破壞,腸道通透性增加,進而有害菌及其代謝產物內毒素等會被吸收入血,進一步加重黏膜上皮細胞的損傷和黏膜屏障的破壞,由此形成惡性循環,導致UC反復發作[25]。本研究通過16S rRNA基因測序探究MOLP對UC小鼠腸道菌群的影響,發現MOLP可以提高UC小鼠腸道菌群的多樣性,恢復Campylobacterota和Bacteroidetes比例,調節不同菌群的相對豐度,促進腸道菌群結構向正常水平恢復。消化系統中最常見兩大菌門為Firmicutes和Bacteroidetes,有研究發現腸炎小鼠Firmicutes和Bacteroidetes會明顯減少[26],而經MOLP處理后則明顯緩解了兩大優勢菌群失調的狀態,這與Sun等[27]報道紫甘薯多糖可以緩解由于DSS造模引起的UC小鼠Firmicutes和Bacteroidetes比值降低的結果類似,提示增加該兩種優勢菌群的比例可能對腸炎小鼠有保護作用。進一步的研究分析表明,丁酸鹽可提供腸道內的酸性環境從而抑制有害菌的生長,維持電解質的平衡,促進黏膜炎癥的修復[28]。丁酸鹽在體內主要由腸道中的Firmicutes細菌產生,增加Firmicutes的數量對腸道炎癥具有保護作用,本研究發現MOLP可以促進UC小鼠中Firmicutes數量的增多,激發有益菌的微生物活性來抑制致病菌的生長。

本試驗結果表明,在DSS誘導的UC小鼠模型中,MOLP可以明顯緩解UC小鼠的結腸縮短、體重下降、DAI評分升高現象,降低UC小鼠血清和結腸組織中促炎因子IL-1β、TNF-α、HMGB1的水平,調節TLR4/NF-κB的過度激活并調節UC小鼠腸道菌群的多樣性、組成和相對豐度,從而發揮對UC預防保護作用。今后下一步將會從化學屏障、免疫屏障等方面多角度探討MOLP對UC的作用,本研究以期為辣木葉的開發利用以及MOLP的抗炎效果提供新的思路。