代茶冬青不同季節葉片營養成分分析

鄒 薛,扈嘉鑫,袁虎威,章建紅,鄭炳松,閆道良*

1浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室,杭州 311300;2寧波市農業科學研究院,寧波 315040

代茶冬青(Ilexvomitoria)隸屬于冬青科冬青屬,是一種富含咖啡因和抗氧化成分的常綠灌木,其原產于美國東南部,其葉和嫩枝傳統上用來制作健康飲料[1,2]。咖啡因是茶等飲料植物中含有的活性物質,尋找新的富含咖啡因植物資源,以代替茶等常規飲料植物,是保護和減輕原料植物壓力的重要途徑。代茶冬青因具有獨特的活性物質咖啡因,近年來成為“茶”替代品的明星之物,具有巨大的經濟和社會效益,開發和利用前景廣闊。目前,國內外學者對代茶冬青的研究多集中于葉片化學成分方面[3,4],對其年生長周期營養成分含量及其變化鮮有報道。因此,本文以不同季節代茶冬青新鮮葉片為研究對象,采用冷凍干燥法,對其礦質元素和主要有機營養物質含量進行了測定和分析評價,以期為代茶冬青的產業化開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

凱式定氮儀(KND04A,上海昕瑞儀器儀表有限公司);石墨消解儀(HCA-100,上海葉拓科技有限公司);分光光度計(UV-1600,蘇州賽力威儀器有限公司);電感耦合等離子體發射光譜儀(Elan DRC-e,賽默飛世爾科技有限公司);千分之一天平(JE1002,上海浦春計量儀器有限公司);脂肪測定儀(SZF-06A,上海秋佐科技有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1100,賽默飛世爾科技有限公司);酶標儀(800TS-SN,安捷倫科技(中國)有限公司);色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Amethyst C18-H,Sepax);濃硫酸、過氧化氫、高氯酸、鹽酸、濃硝酸(化學純,揚州華富化工有限公司);蒽酮、無水葡萄糖、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、5 mg/L磷標準溶液、乙醇、磷酸、正亮氨酸內標溶液、17種氨基酸標準品(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);石油醚、乙腈、苯酚、冰醋酸、維生素C、無水乙酸鈉(化學純,上海泰坦化學有限公司)。

1.2 植物材料

選取經分類專家鑒定、健壯生長的6年生代茶冬青植株。栽植地位于浙江農林大學東湖校區茶園,土質為疏松的有機黃壤,海拔96 m。以代茶冬青植株當年生枝條上的葉為材料,分別采摘春季(4月)嫩葉、夏季(7月)成熟葉和秋季(10月)老葉,置于低溫盒中,并迅速帶回實驗室,經低溫冷凍干燥、粉碎后用于檢測各項指標。

1.3 測定方法

代茶冬青葉片營養元素的測定按照國家標準或者行業標準。礦質元素中氮含量的測定采用凱式定氮法,磷含量的測定采用鉬銻抗比色法,鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、銅含量的測定參照GB/T 5009.268-2016《食品中多元素的測定》;可溶性糖的測定采用蒽酮比色法[5];可溶性蛋白的測定參照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》;粗脂肪的測定參照GB/T 5009.6-2016《食品中粗脂肪的測定》;維生素C的測定參照GB/T 5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測定》。

氨基酸的測定采用高效液相色譜法:稱取約1.0 g樣本,加入25 mL0.1%苯酚和5 mol/L鹽酸,進行研磨,烘干之后,加入2 mL 0.1 mol/L鹽酸水溶液,過濾膜待衍生,再分別將100 μL上述待衍生的清液和100 μL氨基酸標準品溶液分別置于2 mLEP管中;向每個離心管中依次加入20 μL正亮氨酸內標溶液、100 μL(確保pH>7)三乙胺乙腈溶液、100 μL異硫氰酸苯酯乙腈溶液,混勻后在25 ℃環境下放置1 h,分別往每個離心管里面加入1 mL正己烷,混合均勻后放置10 min。取稀釋5倍的下層溶液經過濾后上機檢測;色譜儀:Agilent 1100高效液相色譜儀,紫外檢測器波長為254 nm,色譜柱:賽分Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫:40 ℃,流速:1 mL/min,進樣體積:10 μL,流動相A:由6.6 g無水乙酸鈉、950 mL蒸餾水、70 mL冰醋酸、70 mL乙腈組成的混合溶液,流動相B:80%乙腈水溶液。按下列洗脫梯度洗脫:0～2 min,100%A;2～15 min,100%A→90%A;15～25 min,90%A→70%A;25～33 min,70%A→55%A;33～38 min:55%A→0%A;35～45 min:0%A→100%A。氨基酸計算方法為各種氨基酸濃度(μg/mL)=F1/F2×C,其中F1為樣本溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積,F2為混合氨基酸標準品溶液中各氨基酸峰面積/內標峰面積,C為混合氨基酸標準品中各氨基酸濃度。

1.4 數據處理方法

1.4.1 適用性檢驗

采用相關系數矩陣直觀檢驗,計算氨基酸之間的Pearson相關系數,依據相關系數矩陣中相關系數的大小得出原始變量之間的線性關系,以此來進行適用性檢驗[6]。

1.4.2 主成分分析法

主成分分析,是考察多個變量之間相關性的一種多元統計分析方法,也就是從原始變量中選取少數幾個變量盡最大可能保留原始變量的相關信息[7-10]。本試驗采用主成分分析法研究代茶冬青葉片中氨基酸的種類與含量,為代茶冬青葉片的開發利用及加工提供理論依據。

1.5 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 代茶冬青葉片礦質營養元素變化

對春、夏、秋3個季節的葉片主要元素含量測定與分析表明(見表1),常量元素氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鎂(Mg)、鈣(Ca)和硫(S)含量變化范圍分別為11.892～17.002、0.716～1.886、12.513～14.009、1.753～2.943、3.736～5.466和0.753～1.400 g/kg;微量元素中鐵(Fe)、錳(Mn)、鋅(Zn)和銅(Cu)含量變化范圍分別為66.823～81.090、693.243～1512.076、181.996～276.173和11.270～12.210 mg/kg。

表1 代茶冬青不同季節葉片礦質營養元素含量

代茶冬青葉片礦質元素含量在不同季節采摘總體表現為春季最高,秋季最低。春季葉片中N、P、Fe、Mn顯著高于夏季與秋季(P< 0.05),其中N含量高達17.002 g/kg。夏季的S含量顯著高于春季和秋季;秋季的Ca含量顯著高于春季和夏季;春季和秋季K、Mg、Zn、Cu含量差異不顯著;春、夏、秋三個季節K、Cu含量差異不顯著。綜上結果表明,春季采摘的嫩葉具有較為豐富的礦質元素。

2.2 代茶冬青葉片主要營養成分變化

對春、夏、秋3季的代茶冬青葉片可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪和維生素C的含量測定與分析表明,不同采摘季節葉片的營養成分差異顯著(見表2)。可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪和維生素C含量變化范圍分別為269.808～447.786、13.163～28.959、1.986～3.046和17.106～29.101 mg/g。春季可溶性糖、可溶性蛋白和粗脂肪含量均最高,分別為447.786、28.959和3.046 mg/g,進入夏季后,含量呈現下降趨勢,進入秋季這三者的含量又分別提高為324.657、16.175和2.401 mg/g。維生素C含量在秋季最高,為29.101 mg/g,總的來說,在不同采摘季節這4種營養物質變化較為明顯,春季采摘嫩葉是獲取這4種營養物質含量最高的最佳時期。

表2 代茶冬青不同季節葉片營養成分含量

2.3 代茶冬青葉片氨基酸含量變化

如表3所示,在春季,葉片氨基酸含量最高的是精氨酸,為402.807 μg/g,最低的是甲硫氨酸,為21.618 μg/g。在夏季,葉片氨基酸含量最高的是天冬氨酸,為324.169 μg/g,最低的是半胱氨酸,為11.955 μg/g。在秋季,葉片氨基酸含量最高的是異亮氨酸,為116.341 μg/g,含量最低的是組氨酸,為9.281 μg/g。葉片總氨基酸含量最高的是春季,為1 645.139 μg/g,其次是夏季,為1 425.104 μg/g,最低的是秋季,為554.806 μg/g。葉片中人體必需氨基酸含量最高的是春季,為571.620 μg/g,其次是夏季,為394.809 μg/g,最低的是秋季,為225.185 μg/g。綜上,代茶冬青葉片中17種氨基酸含量在春季采摘含量呈現最高,在秋季采摘則最低,兩者差異顯著(P< 0.05)。

表3 代茶冬青不同季節葉片氨基酸含量

2.4 代茶冬青葉片氨基酸相關性分析

由表4可知,17種氨基酸之間具有不同程度的相關性,其中Asp與Glu、Ser、His、Lys、Thr之間,Glu與Ser、His,Ser與His之間,Gly與Ala、Ar、Tyr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Leu之間,His與Thr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Leu之間,Arg與Pro、Val、Cys、Ile之間,Thr與Lys、Leu、Ile、Val之間,Ala與Lys、Leu、Ile、Val之間,Pro與Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe之間,Phe與Ala、Pro、Tyr、Val、Lys、Leu之間,Lys與Phe之間均呈極顯著正相關(P<0.01)。Thr與Gly之間,Ala與His、Arg之間,Pro與Thr之間,Tyr與Arg之間,Met與Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Val之間,Cys與His、Arg、Thr、Pro、Val之間,Ile與Ala、Met之間,Leu與Met之間,Phe與Met、Ile之間,Lys與Glu、Tyr、Val、Met、Leu之間呈顯著正相關(P<0.05),其他氨基酸之間沒有呈現明顯的相關性。由于不同氨基酸之間相關性信息復雜,不能夠直觀評價葉片氨基酸營養品質,因此采用主成分分析,以此來直觀地反映研究對象并對其作出客觀的評價,便于研究代茶冬青葉片的營養品質。

2.5 葉片氨基酸主成分分析

對3個季節代茶冬青葉片中17種氨基酸進行主成分分析,由圖1、圖2、表5可知第1主成分方差貢獻率占總變異信息的64.490%,第2主成分方差貢獻率占總變異信息34.395%,累計方差貢獻率達到98.885%,代表了葉片17種氨基酸的絕大部分信息,可以反映17種氨基酸的綜合性狀,因此選擇前2個主成分作為綜合指標對其品質進行綜合評價。

圖1 代茶冬青不同季節葉片氨基酸主成分提取碎石圖

圖2 代茶冬青不同季節葉片氨基酸主成分圖

表5 代茶冬青不同季節葉片氨基酸主成分的初始特征值及累計方差貢獻率

由表6可知Gly、Ala、Phe、Pro、Tyr、Met、Cys、Val、Leu、Ile、Lys和Arg在第1主成分上有較大的載荷,載荷系數分別為0.913、0.996、0.971、0.953、0.998、0.897、0.563、0.975、0.999、0.814、0.889和0.761,說明第1主成分基本代表了這些氨基酸的信息;Asp、Glu、Ser、His和Thr在第2主成分上有較大的載荷,載荷系數分別為0.903、0.973、0.860、0.976和0.577,說明第2主成分反映了這些氨基酸的信息,因此選擇前2個主成分作為綜合指標對其氨基酸品質進行綜合評價。

表6 代茶冬青不同季節葉片氨基酸主成分載荷矩陣

以特征值的貢獻率大小為分配系數[11-13],計算出每個主成分的特征值與所提取主成分總的特征值之和的比例,以此作為權重,最后得出主成分綜合得分模型:

F1=0.130Asp+1.823Glu+0.215Ser+0.031Gly+0.045His+0.237Arg+0.051Thr+0.311Ala+0.297Pro+0.311Tyr+0.304Val+0.280Met+0.176Cys+0.254Ile+0.312Leu+0.302Phe+0.277Lys。

F2=0.373Asp+0.402Glu+0.356Ser-0.164Gly+0.404His-0.266Arg+0.239Thr+0.0261Ala-0.121Pro-0.101Tyr-0.088Val+0.169Met-0.321Cys-0.236Ile-0.012Leu+0.097Phe+0.185Lys。

對其按綜合主成分分值進行排序,即可對不同季節葉片營養進行綜合評價比較,結果見表7。

表7 代茶冬青不同季節葉片氨基酸主成分得分和綜合得分

由表7可以得出,在第1主成分中,3個季節葉片得分最高的是春季,最低的是秋季,即春季中Gly、Ala、Phe、Pro、Tyr、Met、Cys、Val、Leu、Ile、Lys、Arg含量較高;第2主成分中,得分最高的是夏季,即夏季Asp、Glu、Ser、His、Thr含量較高。3個不同季節代茶冬青葉片所含氨基酸綜合評價得分按從高到低排序依次為夏季、春季、秋季。夏季的綜合評價得分最高,說明夏季葉片氨基酸綜合品質較高,秋季的綜合評價得分最低,其氨基酸綜合品質較低。

3 討論與結論

作為飲品的“茶”葉中各生化成分的含量受“茶”樹品種、季節、自然環境等影響較大,不同季節“茶”葉各生化成分存在明顯的差異和一定的變化規律[14-16]。我們對代茶冬青葉片各生化成分分析表明,礦質元素中N、P、Fe、Mn含量春季最高,因為春季是樹葉生長的時期,營養狀況良好,且營養元素向新生葉片轉移[17];K元素含量雖然在生長期內逐漸降低,但變化幅度較小,表明代茶冬青葉片K元素受季節影響不大;其次數據分析可得春季和秋季代茶冬青葉片中Zn和Cu含量都高,Zn和Cu是蛋白質的組成成分,這可能春季和秋季蛋白質含量都高有關[18]。可溶性糖、氨基酸等含量在不同季節間存在顯著差異,其中可溶性糖、可溶性蛋白春季最高、夏季最低,這與Huang等[19]的研究的結果一致。這可能是因為植物剛開始復蘇生長的時候需要更多營養物質流向嫩葉。在夏季,植物的新陳代謝加快,營養元素被消耗,糖類、蛋白類物質被分解轉化,所以可溶性糖、可溶性蛋白含量減少。秋季代謝減弱,物質開始積累,可溶性蛋白含量增加。同時春季氨基酸含量最高,這與前人對“黃金茶”成分研究結果一致[20],原因可能是春季氣溫適中,浙江雨水充沛,加上茶樹經過秋冬季節較長時間的休養生息,內在成分及含量較為豐富,特別是氨基酸含量。此外有研究認為氨基酸含量高,且含有一定量的咖啡因是適宜制綠茶的品種特征要求[21,22]。氨基酸是茶葉的主要化學成分之一,其含量與綠茶品質呈正相關[23-25],加上春季芽葉色澤翠綠,香氣濃烈,可以說代茶冬青作為春茶采摘是一年當中最優質的茶,而秋季的氨基酸含量低于春夏季,這與Zhou等[26]對茶的生化成分研究結果一致,原因可能是因為秋季茶樹歷經春夏兩個季節的采收,缺乏體內營養物質。因此針對代茶冬青開發為茶葉利用時,春季采摘是開發利用最適宜的季節。

本文通過對代茶冬青葉片營養成分進行測定與分析,研究結果表明代茶冬青春季葉片中含有較高的礦質元素、可溶性糖、可溶性蛋白和粗脂肪。利用主成分分析法對代茶冬青3個季節葉片氨基酸進行分析,得到2個主成分。以方差貢獻率為權重,依據各主成分得分值與方差貢獻率建立綜合評價模型,得到不同季節葉片氨基酸含量的綜合得分,氨基酸含量綜合評價得分排序為夏季>春季>秋季。綜上所述,春季營養物質含量最高,夏季葉片氨基酸較為豐富,秋季代茶冬青葉片中含有較高的維生素C。因此在實際生產中,可根據需求選擇不同季節代茶冬青葉片開發成多種產品。