基于液質聯用的金錢草及其習用品的化學成分差異性分析

周永逸,陳海杰,薛 佳,袁嘉歡,吳 楠,劉訓紅,2*,鄒立思,程建明,2

1南京中醫藥大學藥學院;2江蘇省經典名方工程研究中心,南京 210023

金錢草系報春花科植物過路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草[1],主要產自中國云川貴等地?，F代研究表明,金錢草含有黃酮、有機酸、揮發油、鞣質和氨基酸類等化學成分[2],其主要藥效成分為黃酮類和有機酸類成分,有利濕退黃、解毒消腫等功效,臨床上用于治療肝膽結石、濕熱黃疸等癥[3]。金錢草作為中醫臨床配伍常用藥,市場上常出現一些習用品或混偽品[4]。例如,江浙一帶將連錢草作為金錢草習用,具有利濕通淋、散瘀消腫和清熱解毒等功效[5];另有將小金錢草作為金錢草習用,亦具有清熱解毒、利濕散瘀等作用[6]。這導致金錢草藥材使用混亂,影響臨床用藥的安全、有效。

目前,關于金錢草及其習用品、混偽品的鑒別,多采用傳統的性狀鑒別、顯微鑒別[7]和薄層色譜(TLC)鑒別[8]。此外,還應用紅外光譜法[9]和DNA條形碼技術[10]探究金錢草及其習用品、混偽品的比較鑒別。關于金錢草及其習用品的化學成分分析,常采用高效液相色譜法(HPLC),其中測定蘆丁、槲皮素和山柰酚等單一或少數黃酮類成分的含量[11],且儀器靈敏度低,分析所需要的時間較長,難以滿足日漸提高的中藥質量控制要求。近年來,由于液質聯用(LC-MS)技術具有液相高分離能力和質譜高選擇性、高靈敏度,已廣泛應用于中藥復雜系統的定性和定量分析[12]。

本文基于超快速液相色譜-三重四級桿飛行時間質譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)分析金錢草及其習用品中化學成分的差異性,并篩選、鑒定差異化學成分;用超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)同時測定已鑒定的共有差異成分的含量,并對金錢草與小金錢草、連錢草進行比較分析。本研究可為金錢草及其習用品的藥材鑒別和質量控制提供新的方法參考,同時為揭示其藥效差異及臨床合理用藥提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

SIL-20A XR超快速液相色譜儀,包括LC-20AD二元輸液泵、STL-20A XR自動進樣器和CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司);Triple TOFTM5600 System高分辨四極桿飛行時間質譜儀和AB QTRAP 5500三重四極桿線性離子阱質譜儀(配有Analyst 1.6.2軟件,美國AB SCIEX 公司);湘儀H1650-W高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司);KQ-500B超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)。

MS級甲酸(美國ThermoFisher公司);HPLC級甲醇(美國Merck公司),純度大于99%;蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

對照品:綠原酸(chlorogenic acid,批號Y22M8K36544)、金絲桃苷(hyperin,批號P12S11F 124379)購于上海源葉生物科技有限公司;槲皮苷(quercitrin,批號111538-200302)購于中國食品藥品檢定研究院;異槲皮苷(isoquercitrin,批號102824)購于江蘇永健醫藥科技有限公司;蘆丁(Rutin,批號0080-9705)購于中國生物制品檢定所;山柰酚-3-O-蕓香糖苷(kaempferol 3-O-rutinoside,批號DST200619-075)購于成都德斯特生物技術有限公司,以上標準品純度均大于98%。

金錢草(S1)和小金錢草(S2)樣品均在2022年1月10日于四川省巴中市采集,連錢草(S3)樣品在2022年1月16日于江蘇省淮安市采集,每一藥材均有4個批次,采集后篩選出雜質并立即曬干。藥材樣品均經南京中醫藥大學劉訓紅教授鑒定,金錢草為報春花科植物過路黃LysimachiachristinaeHance的干燥全草,小金錢草為旋花科植物馬蹄金DichondrarepensForst.的干燥全草,連錢草為唇形科植物活血丹Glechomalongituba(Nakai) Kupr.的干燥地上部分。以上樣品均留存樣本于南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室,標本編號分別為20220110001～20220110004(S1)、20220110005～20220110008(S2)、20220116001～20220116004(S3)。

1.2 溶液制備

1.2.1 對照品溶液的制備

稱取對照品適量置容量瓶中,精密稱定后加入80%甲醇溶解分別配制成對照品儲備液,置于4 ℃冰箱中保存備用。取上述對照品儲備液適量,定容至10 mL容量瓶中配成混合對照品溶液,搖勻后加80%甲醇逐級稀釋,以0.22 μm微孔濾膜過濾后注入UFLC系統。

1.2.2 供試品溶液的制備

取金錢草、小金錢草和連錢草藥材,用粉碎機粉碎后過三號篩。稱取藥材粉末0.5 g置具塞錐形瓶中,精密稱定后加入5 mL的80%甲醇,稱量,室溫下超聲(500 W,40 kHz)60 min,用相同濃度的甲醇補足重量,搖勻過濾,濾液離心(12 000 r/min,8 min),以0.22 μm微孔濾膜過濾后注入UFLC系統。

1.3 樣品化學成分的UFLC-Triple TOF-MS/MS定性分析

1.3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流動相由甲醇(A)和0.1%甲酸水(B)組成,梯度洗脫程序:0～2 min,5%→30% A;2～25 min,30%→55% A;25～30 min,55%→5% A;30～32 min,5%A。進樣10 μL;流速為0.8 mL/min;檢測波長為360 nm;柱溫為30 ℃。

1.3.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)負離子模式;噴霧電壓(IS):-4 500 V;離子源溫度(TEM):600 ℃;脫簇電壓(DP):-100 V;簾氣流速(CUR):40 psi;霧化氣體流速(GS1):60 psi;輔助氣體流量(GS2):60 psi;離子噴射電壓浮動(ISVF):4 500 V;數據采集時間32 min。

1.3.3 統計分析

使用Peakview 1.2和MarkerView 1.2.1對原始數據進行峰匹配、峰對齊和濾噪處理,結果進一步導入SIMCA-P 13.0軟件。在定性結果的基礎上,使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)對數據進行降維分析,以獲得關于組間差異的信息。首先采用PCA初步觀察各樣品的聚集情況,表現金錢草、小金錢草、連錢草之間的化學組成差異;再用PLS-DA對各樣品進行分類,根據模型得到的變量重要性投影(variable importance for the projection,VIP)值和t檢驗結果,以VIP>1且P<0.05為條件篩選出差異性化學成分的特征峰,從而找到潛在的差異化學成分[13]。

1.3.4 差異化學成分的鑒定

一級質譜確定精確相對分子質量,使用Peakview 1.2軟件中IDA explore功能獲得二級質譜離子,推測裂解方式,結合文獻、對照品比對以及ChemSpider(https://chemspider.com/)、MassBank(https://massbank.eu)、METLIN(https://metlin.scripps.edu/)和HMDB(https://HMDB.ca/)等數據庫搜索,對差異化學成分進行鑒定。

1.4 共有差異成分的UFLC-QTRAP-MS/MS定量分析

1.4.1 色譜條件

Waters XBridge?C18色譜柱(4.6 mm × 100 mm,3.5 μm);流動相由甲醇(A)和0.4%甲酸水(B)組成,梯度洗脫程序:1～4 min,7%→35% A;4～5 min,35%→40% A;5～8 min,40%→45% A;8～10 min,45%→48% A;10～11 min,48%→5% A;11～12 min,5% A。進樣2 μL;流速為0.8 mL/min;柱溫為30 ℃。

1.4.2 質譜條件

ESI-掃描,負離子模式下IS:-4 500 V,多反應監測模式(MRM)檢測;TEM:550 ℃;CUR流速:40 psi;GS1和GS2流速:55 psi;全程接口通入氮氣,數據采集時間12 min。

1.4.3 方法學考察

1.4..3.1 線性關系、檢出限和定量限

混合標準品已知的質量濃度(ng/mL)為橫坐標(X),測得的對應峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得到6個成分的回歸方程和對應的相關系數(r)。同時,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)時成分的質量濃度作為檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ),結果見表1。本文在正式實驗前進行了預實驗,發現6個成分在樣品中含量相差較大,為了成分的線性范圍能包含樣品中成分的含量,我們根據預實驗結果估測出各個成分的濃度范圍,配置好的混合標準品溶液逐級稀釋后進樣分析,得到表1中的線性范圍。6個差異化學成分在一定濃度范圍內均呈良好的線性關系,r均不低于0.999 4,LOD為0.18～0.85 ng/mL,LOQ為0.60～2.83 ng/mL。表中山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量較低的時候檢測不夠靈敏,不能夠呈良好的線性關系,因此最低濃度與最低檢出限相差較大。

表1 6個成分的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限

1.4.3.2 精密度、重復性和穩定性試驗

取同一濃度的混合對照品溶液2 μL,在1 d內連續6次進樣分析,記為日內精密度;每天進樣3針,連續3 d進樣分析,記為日間精密度。計算得到峰面積的相對標準偏差(RSD)值均小于5.00%,說明儀器具有良好的精密度;稱定同一樣品6份,每份0.5 g,進樣后計算6個成分的峰面積的RSD值范圍是1.79%～4.07%,表明該方法具有較好的重復性;取同一供試品溶液,分別在6個時間點(0、2、4、8、12和24 h)進樣分析,計算得出峰面積的RSD值范圍是1.15%～3.00%,表明供試品溶液在24 h內穩定性較強。具體結果見表2。

表2 6個成分的精密度、重復性、穩定性和加樣回收率

1.4.3.3 加樣回收試驗

取0.25 g已知含量的樣品9份置于具塞錐形瓶中,精密稱定后分別添加低、中、高三個水平(80%、100%、120%)的混合標準品溶液。每個濃度都制備3個平行樣品,按照“1.2.2”項下的方法制備,計算各成分的平均回收率。最終,綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷的平均回收率分別為100.14%、100.80%、99.77%、100.21%、101.89%和100.75%,RSD值均小于5.00%,表明此方法準確度較好,可以用于樣品的測定,結果見表2。

2 結果與分析

2.1 供試品制備方法的優化

實驗前期分別對提取溶劑(60%、70%、80%、90%、100%甲醇;60%、70%、80%、90%、100%乙醇)、提取時間(15、30、45、60、75、90 min)以及料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL))進行單因素考察。結果表明,80%甲醇溶液、1∶10料液比、60 min超聲提取效率最佳。為了確定1∶10的料液比是否提取率最高,因此又重新配置了1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(g/mL)這5種料液比,用80%甲醇超聲提取60 min,結果顯示1∶10的料液比提取效率更高,因此選擇在室溫下用80%甲醇、1∶10的料液比,超聲60 min作為優化的提取條件。

2.2 樣品化學成分的差異性分析

2.2.1 色譜-質譜條件的優化

實驗前期考察了不同流動相(甲醇-0.1%甲酸水、乙醇-水、甲醇-水和乙腈-0.1%甲酸水)在梯度洗脫下對樣品中各峰分離度的影響,結果顯示以甲醇作為洗脫劑A,0.1%的甲酸水作為洗脫劑B,化合物分離的效果較好。同時,液相色譜用檢測波長測定時一般都選擇在對樣品有最大吸收的波長下進行,以獲得最大的靈敏度和抗干擾能力。為了獲得更好的分離效果、響應值及減小干擾,考察了不同檢測波長(254、300、360 nm)對檢測結果的影響。結果表明,當檢測波長為360 nm時,成分有最大的響應值,受雜質干擾小,因此選擇360 nm作為檢測波長。前期查閱文獻可知,金錢草、小金錢草和連錢草中產生藥理作用的主要是黃酮和有機酸類成分[14-16],分別在正負離子模式下進樣,發現黃酮類和有機酸類成分均在負離子模式下具有更高的響應,因此本實驗對樣品在負離子模式下進行測定。負離子模式下金錢草、小金錢草和連錢草的UFLC-Triple TOF-MS/MS基峰圖如圖1所示。

圖1 金錢草(S1)、小金錢草(S2)、連錢草(S3)負離子模式下的UFLC-Triple TOF-MS /MS基峰圖

2.2.2 主成分分析(PCA)

PCA是一種使用降維概念將變量重新組合為新的復合變量的統計方法,從中選擇少數變量以反映大多數原始信息。用SIMCA-P 13.0軟件對金錢草、小金錢草和連錢草樣品進行PCA分析,模型的驗證結果(R2X=0.952,Q2=0.918)表明該模型穩定,結果可靠。如圖2所示,三者樣品各自聚為一類,說明金錢草、小金錢草、連錢草每個批次樣品間的化學成分比較穩定;另外,金錢草、小金錢草、連錢草樣品分類結果較為理想,分布在坐標軸上的三個不同區域,說明它們之間的化學成分存在差異。其中,金錢草和連錢草分布的距離較遠,金錢草位于PC1軸負半軸和PC2軸負半軸,而連錢草處在PC1軸正半軸和PC2軸正半軸,說明兩者化學成分差異較大。

圖2 金錢草及其習用品負離子模式下PCA得分圖

2.2.3 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

PLS-DA是一種有監督的判別分析統計方法,通過建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型,從而來實現對樣品類別的預測。實驗對金錢草、小金錢草和連錢草樣品兩兩進行PLS-DA分析,結果如圖3所示。模型驗證結果(R2Y=0.999、0.989、0.998,Q2=0.999、0.986、0.997)表明該模型有效可靠。

圖3 金錢草及其習用品PLS-DA得分圖(a)和VIP得分圖(b)

2.2.4 差異化學成分的鑒定

以VIP>1且P<0.05為條件篩選具有差異性表達的化合物,并對符合條件的差異化學成分進行鑒定,最終鑒定出13個化學成分,結果見表3。其中6種成分為它們的共有差異化學成分,分別是綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

2.3 共有差異成分的定量分析

2.3.1 色譜-質譜條件的優化

為了讓6種成分在較短的分析時間內達到最佳的分離,實驗對色譜柱、流動相進行了考察。首先考察了Waters XBridge?mm,3.5 μm)、ZORBAX Extend-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18(2.1 mm×150 mm,2.2 μm)色譜柱對6個目標成分的分離效果。結果顯示,前者色譜柱檢測靈敏度高,分離效果優于后兩者;同時,實驗考察了在梯度洗脫下不同流動相(甲醇-0.4%甲酸水、乙醇-水、乙腈-0.4%甲酸水和乙腈-水)對樣品中各峰分離度的影響,結果顯示以甲醇作為洗脫劑A,0.4%的甲酸水作為洗脫劑B色譜峰的分離度最好。

取6種成分的單獨標準品溶液,在MS Only模式下,將溶液注入UFLC系統,調整質譜條件獲得各化合物的母離子信息。將母離子進行碰撞誘導,之后尋找合適的特征子離子,再通過優化碰撞能量、去簇電壓等條件,得到各成分的特征碎片離子及相應的質譜條件。實驗前期分別在正離子和負離子模式下對6種成分標準溶液進行全掃描,觀察其響應程度。由于待測化合物大多含有羥基,氫質子易失去,所以6種成分在負離子模式下有更好的響應。得到優化后的質譜參數和保留時間見表4,提取離子色譜圖見圖4。

圖4 6種成分的提取離子色譜圖

表4 6種成分的質譜檢測參數

2.3.2 樣品含量測定

根據表1中線性方程計算樣品中各個成分的含量,最終結果如表5,含量堆積圖如圖5所示。圖中可以清晰看出,6種化學成分含量在金錢草、小金錢草和連錢草樣品中存在明顯差異,在金錢草樣品中蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷這的含量較高,其余的4種成分在小金錢草樣品中含量較高,而連錢草中每種成分的含量均最少。從共有差異化學成分含量總量來分析,小金錢草中6種成分的含量總量最多,而連錢草中6種成分的含量總量最少。

圖5 金錢草及其習用品中6種成分的含量柱狀圖

表5 6種成分的含量測定結果

3 討論與結論

本文首先參考了植物代謝組學的思路,建立了UFLC-Triple TOF-MS/MS方法,首先運用PCA,結果顯示金錢草、小金錢草、連錢草樣品分布在坐標軸上的三個不同區域,說明它們之間的化學成分存在差異。并根據PLS-DA后得到的VIP值和t檢驗結果,篩選并鑒定出了13種差異化學成分,其中6種為共有差異化學成分,即綠原酸、金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷。6種成分可以進一步分類為1個有機酸類化合物和5個黃酮類化合物,黃酮和有機酸類化合物在抗腫瘤、抗炎、保護血管和抗氧化方面有顯著貢獻[17,18]。文獻記載,金錢草、小金錢草和連錢草對治療結石都有效果,其中連錢草在臨床上治療尿路結石效果更佳,金錢草更適宜治療肝膽結石[19]。除此以外,小金錢草在苗族民間為治療肝炎的常用藥?；瘜W成分和含量的差異可能是導致三者功效及臨床使用不一致的原因,因此對這6種共有差異化學成分的含量進行同時測定,分析金錢草及其習用品中差異化學成分的含量變化,為探究金錢草、小金錢草及連錢草的藥效差異的物質基礎具有一定意義。

建立UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定6種差異化學成分含量的方法,結果顯示,蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷這2種成分在金錢草中的含量比較高,其余4種成分在小金錢草中含量較高。其中,金錢草樣品中蘆丁的含量最高,平均含量為127.16 μg/g,是小金錢草的2.4倍,連錢草的71倍;小金錢草樣品中槲皮苷含量最高,平均含量為177.30 μg/g;連錢草樣品中綠原酸的含量最高,平均含量為66.83 μg/g?，F代藥理學研究表明,蘆丁具有很強的抗氧化能力,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[20];Yu等[21]通過體外細胞實驗驗證了山柰酚-3-O-蕓香糖苷具有抗炎以及內皮保護的藥理活性,同時蘆丁和山柰酚-3-O-蕓香糖苷都具有神經保護的作用[22];金絲桃苷能夠改善心血管功能,具有抗腫瘤、抗抑郁等功效[23];綠原酸能夠治療代謝類的疾病,且具有抗菌、抗炎等藥理作用[24];槲皮苷與金絲桃苷藥效類似,具有抗腫瘤、抗抑郁等功效外,還有潛在的降血糖、降血脂等作用[25];異槲皮苷具有保護心血管、抗應激、降血糖及抗過敏等多種藥理作用[26]。6個成分在含量上存在顯著差異,都具有廣泛的藥理作用,可能是導致藥材功能和主治不一致的原因,但是由于中藥中含有多個成分和靶點,其療效的發揮是協同作用的結果,所以產生臨床療效變化差異的物質基礎仍需要更深入的研究。

本文基于UFLC-Triple TOF-MS/MS結合PCA、PLS-DA探究金錢草及其習用品中化學成分的差異性,并用UFLC-QTRAP-MS/MS同時測定6個共有差異成分的含量。本研究可為金錢草及其習用品的藥材鑒別和質量控制提供新的方法參考,同時為揭示其藥效差異及臨床合理用藥提供基礎資料。