基于網(wǎng)絡藥理學、分子對接技術及體外實驗驗證探討龍葵治療乳腺癌的作用機制

溫 馨,胡錦航*,程 敏,2*,宋忠興

1陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)陜西省創(chuàng)新藥物研究中心,咸陽 712083;2商洛學院,商洛 726000

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一[1],也是女性癌癥相關死亡的主要原因[2]。乳腺癌的患病風險與很多因素有關,如年齡,遺傳,生殖因素以及肥胖等[3]。目前,激素療法、手術、化療和放療是乳腺癌治療的主要策略,然而,由于乳腺癌是一種復雜且高度異質(zhì)性疾病,多藥耐藥和嚴重的副作用限制了這些治療方法的治療效果,因此,迫切需要開發(fā)更有效、更安全的抗乳腺癌藥物[4,5]。在癌癥治療中,中藥和天然產(chǎn)物具有多層次、多途徑、多靶點、高效且副作用小等優(yōu)勢,展現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[6,7]。而中藥及其活性化合物抗乳腺癌具有療效確切,毒副作用小、靶點豐富及機制多樣等特點,中藥來源的抗乳腺癌藥物具有良好的開發(fā)和應用前景。

龍葵(SolanumnigrumL.)是茄科的一種藥用植物,廣泛分布于歐洲、亞洲和美洲。龍葵具抗癌、抗炎,抗氧化、抗菌和抗癲癇等作用,其主要的生物活性成分包括甾體皂苷、生物堿、酚類和多糖[8,9]。現(xiàn)代研究表明,龍葵及其活性成分(主要為甾體類、有機酸類、木脂素類及其他類)可用于治療不同類型的癌癥,如肝癌[10]、宮頸癌[11]、胰腺癌[12]、乳腺癌[13]等。龍葵甲醇提取物可誘導乳腺癌細胞MDA-MB-468發(fā)生自噬和凋亡[14],龍葵水提物和乙醇提取物對乳腺癌細胞MCF-7具有細胞毒性,并誘導MCF-7細胞發(fā)生凋亡和周期阻滯[13,15],除此之外,龍葵也可通過表觀遺傳調(diào)節(jié)發(fā)揮抗乳腺癌的作用[16]。薯蕷皂苷元是一種來源于薯蕷屬植物的天然甾體皂苷元,具有較好的抗腫瘤活性,研究表明薯蕷皂苷元可通過抑制Vav2活性抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移,并影響細胞的遷移行為,揭示薯蕷皂苷元可能具有抗轉移潛能[17]。盡管上述研究取得了一定的進展,但龍葵抗乳腺癌的物質(zhì)基礎、作用靶點及詳細的分子機制尚不完全明確。本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接相結合的技術方法,構建多層次、多角度的“藥物-靶標-通路-疾病”網(wǎng)絡關系,并結合體外細胞實驗進行驗證,明確了龍葵有效成分薯蕷皂苷元可抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖并誘導細胞發(fā)生凋亡,初步探討了薯蕷皂苷元的作用分子機制,為龍葵治療乳腺癌的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 龍葵活性成分篩選及作用靶點獲取

采用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫以藥物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥ 30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥ 0.18[18]為篩選依據(jù),獲得龍葵的活性成分。此外,通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPredicition(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫[19]收集龍葵有效成分及其作用靶點,篩選后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進行蛋白靶點矯正。

1.2 收集乳腺癌相關靶點

使用GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫以 “breast cancer” 為關鍵詞進行檢索,去重后得到乳腺癌的相關疾病靶點。

1.3 收集龍葵活性成分治療乳腺癌潛在靶點

將挖掘到的乳腺癌相關疾病靶點和龍葵活性成分相關靶點導入線軟件VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進行分析,篩選映射獲取交集得到龍葵治療乳腺癌的潛在作用靶點,并繪制維恩Venn圖。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建

將龍葵治療乳腺癌作用映射的交集靶點輸入STRING 10.5在線軟件(https://string-db.org) 構建蛋白相互作用網(wǎng)絡,然后將PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.0進行拓撲分析,并通過插件MCODE聚類分析共同靶點的度值大小篩選出核心靶點。

1.5 GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析

利用生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID,https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp,Version 6.8)將潛在作用靶點Symbol錄入,Identifier選擇為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,物種選擇為“Homo sapiens”,列表類型選擇為“Gene List”,進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。根據(jù)P值篩選得到GO生物學功能分析結果和KEGG通路富集分析結果,并將獲得的結果通過微生信分析平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制成氣泡圖進行可視化。

1.6 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡構建

將龍葵中藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡與KEGG富集的代謝通路的結果相整合,在 Cytoscape 3.8.0中構建“藥物-活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡中各節(jié)點(node)分別代表活性成分和關鍵靶點基因;網(wǎng)絡中邊(edge)用來連接活性成分與關鍵靶點基因;連接到網(wǎng)絡的節(jié)點以度值(degree)為單位進行表示。網(wǎng)絡中節(jié)點度值越大,表明該有效成分發(fā)揮的作用越強。

1.7 分子對接

將篩選得到的龍葵核心成分與乳腺癌疾病關鍵靶點進行分子對接,分析來計算網(wǎng)絡中關鍵樞紐的親和力。配體的三維(3D)結構從PubChem數(shù)據(jù)庫下載。利用RCSB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲得受體的三維結構。配體和受體由mgltools_win32_1.5.6軟件修復,并保存為PDBQT文件。AutoDock Vina 1.1.2軟件(http://vina.scripps.edu/)用于測試關鍵活性成分和目標蛋白質(zhì)之間對接的親和力。

1.8 實驗細胞

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。細胞株用含10% 胎牛血清的L15培養(yǎng)液培養(yǎng),并置于37 ℃,100%空氣,飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)。

1.9 主要試劑

薯蕷皂苷元(批號:S229101,純度為100%,Selleck生物科技有限公司),用1.205 9 mL的乙醇將50 mg純度為100%的薯蕷皂苷元溶解,終濃度為100 mmol/L,-20 ℃保存;Annexin V-FITC/PI 試劑盒(批號:A211-01,南京諾唯贊生命科技股份有限公司);MTT(批號:906M501,北京索萊寶科技有限公司)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號:P1200-2,北京索萊寶科技有限公司)、Hoechst 33342(批號:20211015,北京索萊寶科技有限公司);蛋白Marker(批號:91227189,Thermo公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:PA115,天根生化科技有限公司);ECL化學發(fā)光底物(批號:180-5001,上海天能生命科學有限公司);兔抗p-AKT1單克隆抗體(批號:9018S,Cell Signaling Technology);兔抗AKT1單克隆抗體(批號:N12151652,沈陽萬類生物科技有限公司)、兔抗EGFR單克隆抗體(批號:N08180628,沈陽萬類生物科技有限公司);鼠抗Bax單克隆抗體(批號:10005017,武漢三鷹生物技術有限公司)、鼠抗Bcl-2單克隆抗體(批號:10022354,武漢三鷹生物技術有限公司)、鼠抗β-action單克隆抗體(批號:10021787,武漢三鷹生物技術有限公司)、HRP標記的山羊抗兔IgG(批號:20000258,武漢三鷹生物技術有限公司)、HRP標記的山羊抗鼠IgG(批號:20000374,武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.10 MTT法檢測薯蕷皂苷元對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

將對數(shù)生長期的細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,加入不同濃度的薯蕷皂苷元培養(yǎng)48 h,棄去上清,每孔加入180 μL無血清的培養(yǎng)基和20 μL 5 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去上清,加入150 μL DMSO溶解MTT甲瓚沉淀,混勻后,使用酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A)。按公式計算腫瘤細胞生長抑制率:抑制率=(1-A樣品/A對照)×100%,以細胞抑制率對藥物濃度對數(shù)作圖,計算出薯蕷皂苷元對MDA-MB-231細胞的IC50值。

1.11 Hoechst 33342檢測細胞形態(tài)

將細胞接種至24孔板中,接種密度為1×105個/孔;細胞貼壁后用不同濃度的薯蕷皂苷元對細胞進行處理。用免疫染色固定液固定細胞,PBS洗3次,按照Hoechst 33342試劑盒中的說明書進行染色,使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.12 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后用不同濃度的薯蕷皂苷元進行處理,48 h后消化細胞并離心收集細胞。使用細胞凋亡檢測試劑盒對細胞進行染色,利用流式細胞儀檢測細胞的凋亡并用Flowjo軟件分析。

1.13 Western blot 檢測相關蛋白的表達

細胞處理同“1.12”,收集細胞,使用RIPA裂解液,提取細胞總蛋白。通過BCA定量法測定蛋白濃度,將等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳。采用濕轉電轉移的方法,將蛋白轉移至PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉(TBST 配制)37 ℃封閉PVDF膜1 h,去除封閉液,孵育一抗(1∶2 000),4 ℃過夜,TBST洗膜三次,室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h,TBST洗膜三次后用ECL發(fā)光液顯影,使用ChemiDoc XRS圖像系統(tǒng)結合Image Lab軟件進行圖像采集以及數(shù)據(jù)分析。

1.14 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 龍葵活性成分篩選及作用靶點確定

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫,并結合相關文獻報道,根據(jù)OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18篩選出符合條件且剔除無對應靶點信息的龍葵活性成分共7個(見表1)。

2.2 龍葵治療乳腺癌的潛在作用靶點預測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選獲得乳腺癌相關靶點1 729個,利用在線軟件Venny2.1對乳腺癌相關靶點和龍葵活性成分相關靶點進行映射,取交集后,獲得共同靶點110個,即龍葵可能通過多個潛在作用靶點協(xié)同治療乳腺癌(見圖1)。

圖1 龍葵活性成分相關靶點與乳腺癌相關靶點韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡構建

將龍葵與乳腺癌的110個共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫,獲得PPI網(wǎng)絡,利用Cytoscape 3.8.0進行網(wǎng)絡可視化(見圖2)。該網(wǎng)絡中涉及110個節(jié)點,1 096條邊,其中節(jié)點表示靶基因,邊表示靶基因間的相互作用關系。根據(jù)插件的網(wǎng)絡拓撲分析結果顯示,節(jié)點degree平均值為19.9。根據(jù)節(jié)點數(shù)值篩選ERBB2、EGFR、KIT、SRC、ESR1、AKT1、MAPK1、PIK3CA等關鍵靶點,并認為這些靶點對龍葵治療乳腺癌起到關鍵作用。

圖2 PPI網(wǎng)絡互作圖

2.4 靶點的GO富集分析

將龍葵 110 個交集靶點錄入DAVID數(shù)據(jù)庫中,共得到GO富集分析結果694個,其中包括499個生物過程(biological processes,BP)、63個細胞組分(cell composition,CC)和 132個分子功能(molecular function,MF)。各篩選出排名前10的GO富集結果繪制柱形圖(見圖3)。生物富集結果表明激酶活性正調(diào)節(jié)、蛋白酪氨酸激酶活性、結合蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、MAPK級聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、PI3K信號正向調(diào)節(jié)、鋅離子結合、ATP結合等生物過程均在龍葵治療乳腺癌過程中發(fā)揮著重要作用。

圖3 GO功能富集分析

2.5 靶點的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析中篩選得到137條信號通路,取排名前20的通路進行KEGG可視化,繪制氣泡圖(見圖4)。與乳腺癌相關的通路主要有癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號通路、ErbB信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路和Rap1信號通路等。該結果提示龍葵通過作用于多條信號通路來發(fā)揮治療乳腺癌的作用。

圖4 共有靶點的前20條KEGG通路

2.6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建

采用Cytoscape軟件構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖(見圖5),該網(wǎng)絡共有138個節(jié)點,其中7個成分(橙色菱形)、110個靶點(藍色四邊形)、20條通路(綠色圓形),492條邊。圖中用度值(degree)預測出節(jié)點間的關聯(lián)數(shù),且度值越大表明該成分或該靶點越重要。

圖5 龍葵-靶點-疾病及相關通路的互作網(wǎng)絡

2.7 分子對接

根據(jù)龍葵抗乳腺癌互作網(wǎng)絡的主要活性成分,選擇基因網(wǎng)絡中具有大多數(shù)靶點的五個組分和具有高度節(jié)點的蛋白質(zhì)進行分子對接。

表2和圖6為關鍵靶點的活動中心坐標以及對接的結合能,分子對接結合自由能越小,則代表受體與配體間的親和力越大。取與每個蛋白質(zhì)結合最強化合物進行可視化處理(見圖7)。結果顯示,所有化合物與蛋白對接的結合能均小于-6 kcal/mol,說明各化合物與各蛋白均能較好結合。為了驗證上述結果,使用分子對接分析來計算網(wǎng)絡中關鍵樞紐的親和力。

圖6 龍葵活性成分與靶點蛋白結合能熱圖

圖7 薯蕷皂苷元與關鍵靶點分子對接模式圖

表2 活性成分與靶點蛋白結合能

2.8 薯蕷皂苷元對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

MTT實驗表明,與對照組(0 μmol/L)相比,不同濃度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的薯蕷皂苷元對MDA-MB-231細胞增殖的抑制率均顯著增高,說明薯蕷皂苷元可抑制MDA-MB-231細胞的增殖,并且抑制作用呈劑量依賴性(見圖8)。計算薯蕷皂苷元抑制MDA-MB-231細胞的IC50為44.98±3.06 μmol/L,故后續(xù)實驗采用 0、15、30、60 μmol/L薯蕷皂苷元處理MDA-MB-231細胞進行機制研究。

圖8 不同濃度薯蕷皂苷元對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.9 薯蕷皂苷元對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色,并采用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。如圖9所示,對照組細胞核被 Hoechst 33342染成均勻的藍色,呈圓形或橢圓形,不同濃度薯蕷皂苷元處理組則出現(xiàn)典型的凋亡特征,包括不同程度的呈致密濃染的細胞核。

Annexin V-FITC/PI 雙染法結果顯示,與對照組相比,不同濃度(15、30、60 μmol/L)的薯蕷皂苷元均可誘導MDA-MB-231細胞凋亡(見圖10)。

2.10 薯蕷皂苷元對MDA-MB-231細胞中AKT1、p-AKT1、EGFR以及凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot檢測MDA-MB-231細胞中EGFR、AKT1、p-AKT1、Bax、Bcl-2蛋白的表達,β-action 作為內(nèi)參。實驗結果顯示,與對照組相比,薯蕷皂苷元可下調(diào)MDA-MB-231細胞中EGFR蛋白表達,同時上調(diào)AKT1蛋白表達,下調(diào)p-AKT1蛋白表達(見圖11A)。與對照組相比,薯蕷皂苷元可上調(diào)MDA-MB-231細胞中Bax蛋白表達,同時下調(diào)Bcl-2蛋白表達(見圖11B)。

3 討論與結論

龍葵是我國傳統(tǒng)中草藥,現(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)龍葵有多種生物活性,且大多數(shù)集中在抗腫瘤領域[20,21]。有研究表明其活性成分薯蕷皂苷元可通過調(diào)節(jié)多種細胞信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用,且與細胞生長、分化、凋亡等眾多重要的分子靶點密切相關[22,23]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學TCMSP數(shù)據(jù)庫[24]分析,共篩選出梣皮樹脂醇、β-胡蘿卜素、谷甾醇、薯蕷皂苷元、澳洲茄堿、膽固醇和槲皮素7個有效活性成分,將挖掘到的龍葵活性成分相關靶點與乳腺癌疾病靶點導入線軟件VENNY 2.1映射獲取交集,同時PPI網(wǎng)絡分析表明這些交集靶點間具有密切的聯(lián)系。有研究表明,槲皮素、澳洲茄堿和谷甾醇具有抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞凋亡等藥理作用[25-27]。薯蕷皂苷元可促進乳腺癌MCF-7細胞和Skp2細胞的凋亡[28]。由此可見,龍葵有效成分槲皮素、澳洲茄堿、谷甾醇和薯蕷皂苷元可發(fā)揮抗腫瘤作用。

化合物-靶點網(wǎng)絡圖可知,龍葵-疾病靶點取交集后共得到110個靶點,進一步篩選發(fā)現(xiàn)ERBB2、EGFR、KIT、SRC、ESR1、AKT1、MAPK1、PIK3CA等為龍葵有效成分治療乳腺癌的靶蛋白。其中梣皮樹脂醇、薯蕷皂苷元和槲皮素等都作用于AKT1和EGFR靶點,AKT(絲氨酸/蘇氨酸激酶)和EGFR(表皮生長因子受體)在細胞增殖、遷移和代謝等方面具有重要意義。因此,靶向AKT和EGFR對乳腺癌來說是非常有吸引力的治療策略[29,30]。本研究結果表明,在乳腺癌發(fā)展進程中AKT1和EGFR等靶點起著重要作用,并且可能是龍葵治療乳腺癌的潛在作用靶點。GO富集分析可知,龍葵抗乳腺癌的靶基因涉及激酶活性正調(diào)節(jié)、結合蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、MAPK級聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、PI3K信號正向調(diào)節(jié)、ATP結合等生物過程,這些關鍵過程在龍葵治療乳腺癌中發(fā)揮重要作用。KEGG結果顯示,共富集137條信號通路,如癌癥通路、PI3K/Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性信號通路、ErbB信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路等。

分子對接技術探究龍葵的關鍵活性成分和目標蛋白質(zhì)間的親和力,結果表明,槲皮素、谷甾醇和薯蕷皂苷元等作用成分與靶點AKT1、EGFR、ESR1、SRC和MAPK等有良好的結合活性,反映了龍葵主要活性成分薯蕷皂苷元、谷甾醇和槲皮素治療乳腺癌的主要機制可能與以上作用成分和靶點關系密切,龍葵可能通過多靶點及多信號通路對乳腺癌具有一定治療作用。

基于分子對接研究結果,選擇龍葵主要活性成分薯蕷皂苷元進行抗腫瘤實驗,并驗證薯蕷皂苷元對其預測靶點EGFR、AKT1的調(diào)控作用。深入探討薯蕷皂苷元抗乳腺癌潛在的作用機制。實驗結果表明,薯蕷皂苷元可抑制MDA-MB-231細胞增殖并誘導MDA-MB-231細胞凋亡,薯蕷皂苷元可下調(diào)細胞中EGFR蛋白的表達,上調(diào)AKT1蛋白的表達,值得注意的是,薯蕷皂苷元可使AKT磷酸化水平下調(diào),同時薯蕷皂苷元能上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達。

綜上所述,本研究應用網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)平臺分析篩選龍葵主要活性成分,同時分析了龍葵治療乳腺癌的多成分、多靶點、多通路的作用機制,并在體外進行實驗驗證,結果表明龍葵可能作用于AKT1和EGFR等靶點發(fā)揮治療乳腺癌的作用,為進一步深入研究龍葵治療乳腺癌的相關作用機制及后續(xù)龍葵臨床應用研究提供思路和依據(jù)。