紅芪顏色與類胡蘿卜素類成分的相關性研究

王 燕,強正澤,李成義,賈妙婷,魏小成,王明偉,李 碩

甘肅中醫藥大學,蘭州 730000

紅芪(Hedysari Radix)為甘肅道地藥材和特產藥材,是甘肅南部地區振興鄉村經濟的支柱產業之一,甘肅武都區已成為“中國紅芪之鄉”,所產紅芪藥材已形成“米倉紅芪”品牌。課題組實驗觀察發現,紅芪呈現出棕黃色、紅棕色、紅褐色、黃棕色等多樣化的顏色特征。

顏色不僅是中藥辨色論質理論的重要組成部分[1],而且“顏色”作為中藥最直觀的特征,與其內在質量有著緊密聯系。漢代以前人們便開始重視藥物顏色[2,3],如《神農本草經》中以青、赤、黃、白、黑等顏色命名的藥物有68種,《本草經集注》[4]記載樸硝“色青白者佳,黃者傷人,赤者殺人”;《新修本草》[5]記載秦皮“取皮水漬,便碧色,書紙看背,青色者是”;《本草原始》[6]記載白術“惟白為勝”、黃連“黃色鮮明者為勝”、丹參“根皮丹而肉紫者佳”、木香“肉色青者優,黃白者次之,色黑油者下”;《本草綱目》[7]中還記載了藥材顏色與產地的關系,如黃芩“西芩……色黔,北芩……深黃”,說明顏色與中藥的名稱、功效、藥物鑒定、品質、產地等方面存在密切關系。不僅如此,現代研究表明,中藥顏色與其藥性、化學成分密切相關[8-9],是藥材“外部優形”與“內部優質”互為統一的橋梁[10],利用顏色可對藥材的產地、品種[11]、采收期[12]、貯藏[13,14]、炮制工藝[15]等進行判別和評價。同時,顏色可作為藥材質量的評價指標[16],《中華人民共和國藥典》(一部)2020年版[17]中200余種藥材亦將“顏色”作為其質量評價的指標之一。高等植物的葉、花、果及根因富含類胡蘿卜素,其結構為四萜烯色素,呈現出黃色、橙紅色、紅色和紫色,與植物的顏色形成具有密切關系,同時具備抗氧化、光保護、著色、增強免疫力、防癌抗癌等功能與生理活性,已被廣泛應用于食品、保健、護膚與化妝、醫藥、飼養等行業[18-21]。

基于此,課題組以紅芪為研究對象,采用精密色差儀及液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)開展紅芪顏色與類胡蘿卜素類成分的相關性研究,分析顏色與類胡蘿卜素類成分間的關聯關系,解析不同顏色紅芪樣品中類胡蘿卜素類代謝產物的差異性規律,以期為紅芪顏色多樣性產生的原因及質量評價提供參考。

1 材料

1.1 實驗樣品

2021年10月收集12份不同顏色紅芪樣品,經甘肅中醫藥大學藥學院李成義教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的根,標本(編號:Y-2021-AH-01)現保存于甘肅中醫藥大學藥學院中藥鑒定學實驗室。后經過除雜、搓條加工、干燥等產地加工環節制成實驗樣品,以“肉眼”主觀判斷按照顏色分為4組,其中HC1為棕黃色、HC2為紅棕色、HC3為紅褐色、HC4為黃棕色。樣品信息見表1,不同顏色紅芪樣品見圖1。

圖1 不同顏色紅芪樣品

表1 不同顏色紅芪樣品信息

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

液相色譜串聯質譜LC-MS/MS(QTRAP 6500+,SCIEX);離心機(5424R,Eppendorf);電子天平(AS 60/220.R2,RADWAG);球磨儀(MM400,Retsch);離心濃縮儀(CentriVap,LABCONCO);多管渦旋振蕩器(MIX-200,上海凈信);超聲清洗儀(KQ5200E,昆山舒美);高速中藥粉碎機(ZN-04A,北京興時利);精密色差儀(NR110,深圳三恩時)。

1.2.2 試劑

甲醇、乙腈、乙醇(色譜純,Merck);丙酮(色譜純,國藥);甲酸(色譜純,Sigma-Aldrich);氯化鈉(分析純,羅恩);氫氧化鉀(分析純,滬試);甲基叔丁基醚、正己烷(色譜純,安譜實驗CNW);2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)(色譜純,Aladdin);標準品:α-胡蘿卜素(BOC Sciences,7488-99-5-10 mg,純度95%);番茄紅素(羅恩,R007285-100 mg,純度98%);γ-胡蘿卜素(Sigma,54765-1 mg,純度≥90%);β-胡蘿卜素(羅恩,RO19713,純度96%);六氫番茄紅素(BOC Sciences,27664-65-9-1 mg,純度95%);α-隱黃質(BOC Sciences,24480-38-4-1 mg,純度>98%);海膽烯酮(BOC Sciences,432-68-8-1 mg,純度98%);β-檸烏素(BOC Sciences,650-69-1-1 mg,純度95%);八氫番茄紅素(BOC Sciences,13920-14-4-250 μg,純度> 95%);ε-胡蘿卜素(ZCN,ZCN-0020,純度95%);玉米黃質二棕櫚酸酯(zzstandard,ZCN-0126-1 mg,純度95%);花藥黃質(ZCN,ZCN-0231,純度95%);玉米黃質(畢得,BD2134-5 mg,純度98%);紫黃質(sigma,52444-1 mg,純度≥90%);新黃質(BOC Sciences,14660-91-4-1 mg,純度≥99%);葉黃素(阿拉丁,X109574-10 mg,純度90%);β-隱黃質(ExtraSynthese,ZES-0317S-1 mg,純度≥95%);蝦青素(羅恩,R004353-25 mg,純度96%);8′-β-阿樸胡蘿卜素醛(阿拉丁,A106806,純度96%);辣椒紅素(ExtraSynthese,ZES-0312S-5 mg,純度≥95%);辣椒玉紅素(BOC Sciences,470-38-2-1 mg,純度≥90%);角黃素(BOC Sciences,514-78-3-5 mg,純度95%)。

2 方法

2.1 紅芪藥材顏色值測定

2.1.1 供試品的制備方法

取紅芪樣品,粉碎,過4號篩。將粉末置于粉末測試盒中,以測試盒中粉末不隨意晃動為準,蓋上石英鏡片,備用。

2.1.2 樣品測量方法

按上述制備方法制備供試品后,采用精密色差儀(測量條件:照明光源:D65;觀察者角度:10度視角;測量口徑Φ:4 mm),連續測量6次,每份樣品重復3次,記錄L*、a*、b*、C*、h°等顏色值(注:①L*表示顏色亮度,即當L*=0時,為黑色;當L*=100時,為白色;②a*表示紅綠色軸,即當a*<0時,為綠色;當a*>0時,為紅色;③b*表示黃藍色軸,即當b*<0時,為藍色;當b*>0時,為黃色;④C*表示飽和度值;⑤h°表示色調角度值)。

2.1.3 重復性考察

2.1.4 精密度考察

2.2 紅芪藥材類胡蘿卜素類成分的測定

2.2.1 檢測的類胡蘿卜素類成分信息

紅芪藥材中共檢測類胡蘿卜類成分68種,信息見表2。

表2 68種類胡蘿卜素類化合物信息

2.2.2 樣品前處理

紅芪藥材樣品真空冷凍干燥后用球磨儀研磨(30 Hz,1 min)至粉末狀,稱取50 mg研磨后的樣本,用0.5 mL含0.01% BHT(g/mL)的正己烷/丙酮/乙醇混合溶液(1∶1∶1,V/V/V)進行提取,室溫下渦旋20 min后,4 ℃條件下,12 000 r/min,離心5 min,取上清液,重復提取一次后離心合并上清液,將得到的提取液濃縮后,用100 μL甲醇/甲基叔丁基醚混合溶液(1∶1,V/V)復溶,過0.22 μm濾膜后,保存于棕色進樣瓶中,用于LC-MS/MS分析。

2.2.3 色譜質譜采集條件

數據采集儀器系統主要包括超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)(ExionLCTMAD,https://sciex.com.cn/)和串聯質譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)(QTRAP?6 500+,https://sciex.com.cn/)。液相條件主要包括:色譜柱:YMC C30(3 μm,100 mm×2.0 mm i.d.);流動相:A相,甲醇/乙腈(1∶3,V/V)加入0.01% BHT和0.1%甲酸;B相,甲基叔丁基醚加入0.01% BHT;梯度洗脫程序:0 min A/B為100∶0(V/V),3 min為100∶0(V/V),5 min為30∶70(V/V),9 min為5∶95(V/V),10 min為100∶0(V/V),11 min為100∶0(V/V);流速0.8 mL/min;柱溫28 ℃;進樣量2 μL。質譜條件主要包括:大氣壓化學離子源(atmospheric pressure chemical ionization source,APCI)溫度350 ℃,氣簾氣(curtain gas,CUR)25 psi。在Q-Trap 6 500+中,每個離子對是根據優化的去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)進行掃描檢測。

2.2.4 類胡蘿卜素類成分含量測定數據預處理

采用Analyst 1.6.3軟件分析處理質譜數據,得到總離子流圖(A)和提取離子流圖(B)(見圖2),其橫坐標為檢測的保留時間(min),縱坐標為離子檢測的離子流強度(cps)。采用MultiQuant 3.0.3軟件處理質譜數據,參考標準品的保留時間與峰型信息,對待測物在不同樣本中檢測到的色譜峰進行積分校正,以確保定性定量的準確。

圖2 紅芪樣品的總離子流色譜圖(A)和提取離子流色譜圖(B)

2.2.5 標準曲線繪制

取Car_01～Car_07、Car_48、Car_55～Car_68,共22種類胡蘿卜素類成分的標準品配制0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000、5.000、10.000、50.000、100.000、250.000、400.000 μg/mL濃度的標準品溶液,獲取各個濃度標準品的對應定量信號的色譜峰強度數據;以標準品濃度為橫坐標,標準品峰面積為縱坐標,繪制不同物質的標準曲線。其中Car_8～Car_47、Car_49～Car_54,共46種類胡蘿卜素類成分以新黃質(Car_58)為對照,采用半定量法進行測定。所檢測物質的線性方程、相關系數、定量下限(lower limit of quantification,LLOQ)、定量上限(upper limit of quantitation,ULOQ)見表3。

表3 類胡蘿卜素類成分的線性方程

2.2.6 樣品含量測定

按照“2.2.2”樣品前處理方法處理紅芪樣品,采用“2.2.3”色譜質譜采集條件進行進樣,獲得不同樣本的質譜分析數據后,對所有目標物的色譜峰進行積分,通過標準曲線進行定量分析。將檢測到的所有紅芪藥材樣本的積分峰面積代入標準曲線線性方程及公式(1)計算紅芪樣品中該類胡蘿卜素類成分的含量。

(1)

式中:含量單位為μg/g,c表示樣本中積分峰面積代入標準曲線得到的濃度值(μg/mL),V表示復溶時所用溶液的體積(μL);m表示稱取的樣本質量(g)。

2.2.7 樣本質控分析

2.2.7.1 總離子流圖分析

為確保檢測儀器的穩定性,以混合溶液作為QC樣本,在儀器分析過程中,每隔10個檢測分析樣本插入一個質控樣本,通過對同一質控樣本質譜檢測分析的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)進行重疊展示分析,可以判斷項目檢測期間儀器的穩定性,儀器的高穩定性為數據的重復性和可靠性提供了重要的保障。由圖3可知,代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高,即保留時間和峰強度均一致,表明質譜對同一樣品不同時間檢測時,信號穩定性較好。

圖3 總離子流重疊圖

2.2.7.2 QC樣本的CV值分布圖分析

CV值即變異系數(coefficient of variation),是原始數據標準差與原始數據平均數的比,可反映數據離散程度。使用經驗累積分布函數可以分析小于參考值的物質CV出現的頻率,QC樣本的CV值較低的物質占比越高,代表實驗數據越穩定:QC樣本CV值小于0.3的物質占比高于80%,表明實驗數據穩定;QC樣本CV值小于0.2的物質占比高于80%,表明實驗數據非常穩定。由圖4可知,類胡蘿卜素類成分的實驗數據較為穩定,圖中橫坐標代表CV值,縱坐標表示小于對應CV值的物質數目占總物質數的比例,不同顏色代表不同的分組樣本,QC為質控樣本,其中與X軸垂直的兩條參考線對應的CV值為0.2和0.3,與X軸平行的參考線對應物質數目占總物質數的80%。

2.3 數據統計分析

以不同顏色4組12份紅芪樣品的色度值數據,17種類胡蘿卜素類成分含量組成數據庫(未檢出的51種成分舍去,17種成分中部分成分在部分樣品未檢出的數據處理時用0代替),開展單因素方差分析、PCA分析、聚類分析、相關性分析、OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)與差異倍數值(fold change,FC)相結合的差異性類胡蘿卜素類代謝產物篩選,研究不同顏色紅芪的色度值及類胡蘿卜素類代謝產物的變化規律。

3 結果

3.1 不同顏色紅芪樣品的色度值分析

表4 紅芪樣品顏色值

表5 不同顏色紅芪樣品色度值的單因素方差分析

3.2 不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素代謝產物檢測結果

按照“2.2.6”方法測定不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素代謝產物含量,共計檢測68種類胡蘿卜素類成分(見表2),其中檢測出17種成分,包含2種胡蘿卜素與15種葉黃素類成分。已檢出的物質在不同顏色組別之間的含量差異見圖5、表6。由圖5、表6可知,4種顏色間17種類胡蘿卜素成分含量間具有差異,Car_01、Car_17、Car_20三種成分在HC2紅棕色、HC3紅褐色樣品中均有檢出,且都在HC3紅褐色樣品中含量最高,其平均含量分別為0.036 9、0.016 3、0.010 8 μg/g,而在HC1棕黃色、HC4黃棕色樣品中未檢出;Car_04只在HC2紅棕色中檢出0.028 6 μg/g,在HC1棕黃色、HC3紅褐色、HC4黃棕色樣品中均未檢出;Car_15、Car_56、Car_67三種成分在HC1棕黃色、HC2紅棕色、HC3紅褐色中均有檢出,且Car_15在HC3中含量最高0.047 2 μg/g,Car_56、Car_67在HC2中含量最高,其平均含量分別為0.049 6、0.000 5 μg/g,而在HC4黃棕色樣品中未檢出;Car_16在HC2紅棕色、HC4黃棕色樣品中均有檢出,且在HC2中含量最高0.010 7 μg/g,在HC1棕黃色、HC3紅褐色樣品中未檢出;Car_27、Car_51、Car_57、Car_59四種成分在HC1、HC2、HC3、HC4四種顏色樣品中均有檢出,其中Car_27、Car_51、Car_57三種成分在HC2紅棕色樣品中含量最高,其平均含量分別為0.055 7、0.008 2、0.339 2 μg/g,而Car_59在HC3紅褐色樣品中含量最高0.408 7 μg/g;Car_29在HC1棕黃色、HC2紅棕色、HC4黃棕色樣品中均有檢出,且在HC2中含量最高0.293 7 μg/g,而在HC3紅褐色樣品中未檢出;Car_32、Car_33兩種成分只在HC3紅褐色樣品中檢出,其平均含量分別為0.026 1、0.043 4 μg/g,在HC1棕黃色、HC2紅棕色、HC4黃棕色樣品中均未檢出;Car_55、Car_63兩種成分在HC1棕黃色、HC2紅棕色樣品中均有檢出,且Car_55在HC2中含量最高0.018 5 μg/g,Car_63在HC1中含量最高0.018 9 μg/g,而在HC3紅褐色、HC4黃棕色樣品中均未檢出,說明17種類胡蘿卜素類成分在不同顏色紅芪樣品中的分布具有差異性。在此基礎上,進一步由單因素方差分析結果(見表7)可知,4種顏色樣品間Car_59、Car_56兩種成分具有顯著性差異(P<0.05),其他15種成分差異性未達顯著。

圖5 不同顏色組別中類胡蘿卜素類成分含量分布

表6 不同顏色紅芪樣品中類胡蘿卜素類成分的含量

表7 不同顏色紅芪中類胡蘿卜素類成分單因素方差分析

3.3 不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素類代謝產物的PCA分析

為分析不同顏色紅芪樣品間類胡蘿卜素類成分的變化特征,采用SIMCA 14.1軟件中非監督模式識別的主成分分析(principal component analysis,PCA)方法分析數據。不同顏色紅芪樣品間類胡蘿卜素成分的PCA散點圖6(PC1 41.5%、PC2 23.1%)顯示,不同顏色的4組12份樣品均在95%的置信區間內,HC1(H1、H2、H3)棕黃色,HC2(H4、H5、H6紅棕色),HC3(H7、H8、H9為紅褐色)樣品分布較為分散,HC4(H10、H11、H12)黃棕色分布較為緊密,進一步分析發現,H10、H11、H12、H2、H3分布較為接近,類胡蘿卜素類成分信息量較為相似,H4、H8、H9分布較為接近,類胡蘿卜素類成分信息量較為相似,H1、H5分布較為接近,類胡蘿卜素類成分信息量較為相似,H6、H7分布較為接近,類胡蘿卜素類成分信息量較為相似,4種顏色樣品間類胡蘿卜素類成分的分布存在交叉信息與共有信息共存特征。4種顏色整體物質信息組成顯示,紅芪藥材顏色的變化特征與類胡蘿卜素類成分存在聯系,類胡蘿卜素類成分對紅芪藥材顏色的形成具有貢獻。

圖6 不同顏色紅芪樣品間類胡蘿卜素成分的PCA圖

3.4 不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素類代謝產物的聚類分析

分析不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素代謝產物的聚類特征,對不同顏色4組12份紅芪樣品17種類胡蘿卜素代謝物含量數據采用UV(unit variance scaling)歸一化方法處理,通過R軟件ComplexHeatmap包中R程序腳本的繪制聚類熱圖,對代謝物在不同顏色紅芪樣品間的積累模式進行層次聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA),代謝物和樣品同時進行聚類分析(見圖7)。圖7左側聚類線為代謝物聚類線,中上方聚類線為樣品聚類線。由圖可知,4組12份樣品聚為4類,H2、H3、H8、H10、H11、H12聚為一類,H1、H5、H6、H9為一類,H4為一類,H7為一類,結合樣品信息表主觀顏色分類,H1、H2、H3為棕黃色,H4、H5、H6為紅棕色,H7、H9、H8為紅褐色、H10、H11、H12為黃棕色,說明主觀顏色分類與類胡蘿卜素代謝產物分類一致性不高,未嚴格按照4種顏色聚類,不同顏色的樣品間類胡蘿卜素代謝產物種類具有一定的同一性,同一顏色紅芪藥材樣品間類胡蘿卜素代謝產物含量具有差異性,顏色與類胡蘿卜素代謝產物含量間存在一定關系,不同顏色的紅芪樣品間存在差異性代謝物。

圖7 不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素代謝產物聚類熱圖

3.5 紅芪樣品色度值與類胡蘿卜素類成分的相關性分析

圖8 紅芪樣品色度值與類胡蘿卜素類成分的相關性網絡圖

3.6 不同顏色紅芪樣品類胡蘿卜素類代謝產物篩選

為進一步分析HC1組棕黃色、HC2組紅棕色、HC3組紅褐色、HC4組黃棕色紅芪樣品間類胡蘿卜素類代謝產物的差異性規律及差異性代謝物,建立正交偏最小二乘法判別分析模型(OPLS-DA),分別比較HC1與HC2,HC1與HC3,HC1與HC4,HC2與HC3,HC2與HC4,HC3與HC4間的差異性代謝產物。正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結合了正交信號矯正(OSC)和PLS-DA方法,能夠將X矩陣信息分解成與Y相關和不相關的兩類信息,通過去除不相關的差異來篩選差異變量。OPLS-DA對原始數據進行log2轉換后,再進行中心化處理,然后利用R軟件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal函數進行OPLS-DA模型建立,根據OPLS-DA模型分析代謝組數據,繪制各分組的得分圖,進一步展示各個分組之間的差異,篩選變量重要性投影VIP值≥1的代謝物,作為差異性代謝物。評價模型的預測參數有R2X、R2Y和Q2,其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預測能力,理論上接近于1時表示模型越穩定可靠,值越低說明模型的擬合準確性較差,Q2≥0.4較為理想,Q2>0.9時為出色的模型[22]。

HC1與HC2、HC1與HC3、HC1與HC4、HC2與HC3、HC2與HC4、HC3與HC4間的類胡蘿卜素類差異性代謝產物OPLS-DA模型見圖9。由圖9可知,HC1與HC2、HC1與HC3、HC1與HC4、HC2與HC3、HC2與HC4、HC3與HC4等6個比較組的OPLS-DA模型中R2X、R2Y和Q2值符合要求,初步獲得OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP≥1的代謝物,篩選出的不同顏色紅芪樣品間差異類胡蘿卜素類代謝物具有意義。

圖9 不同顏色紅芪OPLS-DA模型

基于OPLS-DA結果,從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP值,初步篩選出不同顏色紅芪樣品間差異類胡蘿卜素類代謝物。因代謝組學數據具有“高維、海量”的特點,因此需要結合單變量統計分析和多元統計分析的方法,并根據數據特性從多角度分析,最終準確地挖掘差異代謝物。本研究不同組之間存在3個生物學重復,因此采取差異倍數FC與VIP值相結合的方法來進一步準確篩選差異代謝物。對于兩組比較,選取VIP≥1的代謝物(VIP值表示對應代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度,一般認為VIP≥1的代謝物則為差異顯著),同時選取FC≥2和FC≤0.5的代謝物(代謝物在對照組和實驗組中差異為2倍以上或0.5以下,則認為差異顯著)進行差異性代謝產物篩選,HC1與HC2、HC1與HC3、HC1與HC4、HC2與HC3、HC2與HC4、HC3與HC4間的類胡蘿卜素類差異性代謝產物見表8。由表8可知,HC1棕黃色與HC2紅棕色、HC1棕黃色與HC3紅褐色、HC1棕黃色與HC4黃棕色、HC2紅棕色與HC3紅褐色、HC2紅棕色與HC4黃棕色、HC3紅褐色與HC4黃棕色的差異性類胡蘿卜素類代謝產物分別為6個、4個、4個、5個、6個、6個,4種顏色間涉及的差異性代謝產物主要為10種,分別為Car_01(α-胡蘿卜素)、Car_04(β-胡蘿卜素)、Car_15(葉黃素二月桂酸酯)、Car_17(葉黃素二肉豆蔻酸酯)、Car_27(紫黃質二丁酸酯)、Car_29(紫黃質肉豆蔻酸酯)、Car_55(花藥黃質)、Car_56(玉米黃質)、Car_57(紫黃質)、Car_59(葉黃素),棕黃色、紅棕色、紅褐色與黃棕色紅芪樣品的顏色形成可能與上述代謝產物有關。

表8 不同顏色紅芪類胡蘿卜素類差異性代謝產物

4 討論與結論

類胡蘿卜素類成分檢測結果顯示,不同顏色紅芪樣品中共計檢測68種類胡蘿卜素類成分,其中檢測出17種成分,包含2種胡蘿卜素與15種葉黃素類成分,未檢出的代謝產物可能是因不含此類成分或者其含量低于儀器的檢測限度。進一步對其含量分析發現,4種顏色樣品間17種類胡蘿卜素類成分含量存在極大值與極小值的特征,在不同顏色紅芪樣品中的分布具有差異性,4種顏色樣品間葉黃素、玉米黃質兩種成分具有顯著性差異(P<0.05),其他15種成分差異性未達顯著。藥材中類胡蘿卜素等成分的合成受到光、采收、產地加工及炮制的影響,因此差異性的形成可能與這些因子的綜合作用有關[10]。

PCA研究結果顯示,4種顏色紅芪樣品間類胡蘿卜素類成分的分布存在交叉信息與共有信息共存特征。紅芪藥材顏色的變化特征與類胡蘿卜素類代謝產物存在聯系,類胡蘿卜素類成分對紅芪藥材顏色的形成具有貢獻。HCA結果顯示,主觀顏色分類與類胡蘿卜素代謝產物分類一致性不高,未嚴格按照4種顏色聚類,不同顏色的樣品間類胡蘿卜素代謝產物種類具有一定的同一性,同一顏色紅芪藥材樣品間類胡蘿卜素代謝產物含量具有差異性,顏色與類胡蘿卜素代謝產物含量間存在一定關系,不同顏色的紅芪樣品間存在差異性代謝物,與PCA得到的結果具有相似性。

OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP與差異倍數值相結合的方法篩選不同顏色紅芪間類胡蘿卜素類代謝產物結果顯示,HC1棕黃色與HC2紅棕色、HC1棕黃色與HC3紅褐色、HC1棕黃色與HC4黃棕色、HC2紅棕色與HC3紅褐色、HC2紅棕色與HC4黃棕色、HC3紅褐色與HC4黃棕色的差異性類胡蘿卜素類代謝產物分別為6個、4個、4個、5個、6個、6個,4種顏色間涉及的差異性代謝產物主要為10種,分別為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、紫黃質二丁酸酯、紫黃質肉豆蔻酸酯、花藥黃質、玉米黃質、紫黃質、葉黃素。

結合其他分析結果,與顏色值具有顯著關系的兩種成分為β-隱黃質月桂酸、紫黃質二丁酸酯,不同顏色紅芪樣品間類胡蘿卜素類成分單因素方差分析具有顯著性差異的葉黃素、玉米黃質兩種成分,因此,與紅芪顏色有相關性的成分主要有11種,分別為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、紫黃質二丁酸酯、紫黃質肉豆蔻酸酯、花藥黃質、玉米黃質、紫黃質、葉黃素、β-隱黃質月桂酸,可分為胡蘿卜素類與葉黃素類兩類。因植物細胞中類胡蘿卜素類代謝產物的累積受到合成、降解、存儲等方式的多層次調控[23,24],同時藥材的生產還涉及“種、采、制、用”等過程的影響,因此藥材所含類胡蘿卜素的總體含量不僅與生物合成途徑上的內部因素有關,而且受到外部因素的調控,綜合作用使不同商品藥材中類胡蘿卜素類成分含量及種類具有差異性,從而使植物表現出不同的顏色。

顏色是電磁輻射或光作用于人體視覺器官后產生的一種心理感受,受到物理性質與心理感受的共同影響,其本質是連續的物理光譜[1]。藥材的呈色機理主要與其呈色物質的共軛體系結構密切相關,分子共軛體系中的π→π*躍遷和含有雜原子的不飽和有機物的p→π共軛體系中的n→π*或n→σ*躍遷是其呈色的主要原因[1,25]。不同顏色紅芪樣品中類胡蘿卜素成分屬于異戊二烯類化合物,是紅芪的顯色成分之一,均含有很多的共軛雙鍵,棕黃色、黃棕色、紅褐色、紅棕色的紅芪可能是因其顯色成分(類胡蘿卜素類代謝產物)的“基態電子”分別吸收了它們的補色紫、綠色2種波段的光產生躍遷而呈色[1],另外,光輻射在傳播過程中遇到散射質點后不同線度的散射質點產生不同類型的散射、折射、干涉及衍射[25],因此紅芪樣品棕黃色、黃棕色、紅褐色、紅棕色的產生可能與類胡蘿卜素類成分的共軛雙鍵的電子躍遷及光傳播至藥材時產生的散射、折射、干涉及衍射等物理現象有關。

綜上所述,棕黃色、紅棕色、紅褐色與黃棕色紅芪樣品顏色值具有顯著差異性。其顏色值與類胡蘿卜素類代謝產物含量間存在關聯關系,4種顏色樣品間17種類胡蘿卜素成分含量存在極大值與極小值的特征,含量分布具有差異性;4種顏色間涉及的差異性代謝產物包括胡蘿卜素類與葉黃素類2類11種,分別為α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、紫黃質二丁酸酯、紫黃質肉豆蔻酸酯、花藥黃質、玉米黃質、紫黃質、葉黃素、β-隱黃質月桂酸,其是紅芪產生顏色的呈色物質之一。棕黃色、紅棕色、紅褐色與黃棕色紅芪樣品的呈色原因可能與上述類胡蘿卜素類代謝產物的含量及種類有關。