白芷中非香豆素類成分研究

王 陽,石璠鈺,盧姿含,溫建牛,肖 瑞,牛夢榮,王冰冰,史社坡

北京中醫藥大學中醫藥研究院中藥現代研究中心,北京 102401

白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根。味辛,性溫。具有解表散寒,祛風止痛,宣通鼻竅,燥濕止帶,消腫排膿的功效。臨床上用于治療感冒頭痛,眉棱骨痛,鼻塞流涕,鼻鼽,鼻淵,牙痛,帶下,瘡瘍腫痛等[1]。白芷為臨床常用大宗藥材之一,據統計,截至目前,中成藥處方數據庫中收錄的含有白芷的中成藥品種達到565個,中藥方劑數據庫中收錄的含有白芷的方劑高達1 836條[2]。為闡明其藥效物質基礎,學者們從白芷中分離鑒定了出一系列的香豆素類成分。此外,也有文獻報道白芷中含有豐富的黃酮類成分[3],但目前尚無從白芷中分離純化出黃酮單體的相關報道。課題組前期在對白芷化學成分的系統研究中,發現白芷中除含有大量的香豆素類成分外,還可能含有生物堿、黃酮等非香豆素類成分,利用LC-MS導向分離技術,成功從白芷中發現多個結構新穎的香豆素二聚體[4],對杭白芷乙醇提取物的大極性部位進行研究,成功分離鑒定了16個吡咯生物堿[5]。本文進一步報道從白芷的水溶性部位分離鑒定的非香豆素類化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Autopol IV全自動旋光儀(美國Rudolf公司);高效液相離子阱飛行時間質譜分析系統:UFLC SIL-20AC自動進樣器,CTO-20AC柱溫箱,SPD M20A紫外檢測器,LC-20ADXR泵,IT-TOF-MS配備ESI離子源(日本Shimadzu公司);Varian 500核磁共振儀(美國Varian公司);島津LC-20AT半制備型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器,二元高壓梯度泵,Labsolution工作站,日本島津);Waters 2998半制備型高效液相色譜儀(美國Waters公司);ODS半制備柱(SunFireTMC18,150 mm×10 mm,5 μm);Sephadex LH-20填料(瑞典Amerasham Biosciences公司);ODS柱色譜填料(Li-Chroprep RP-C18,40～63 μm,德國Merck公司);D101大孔樹脂、柱色譜用硅膠(200～300目)及薄層色譜用GF254硅膠預制板均為青島海洋化工廠生產。

細菌脂多糖(LPS,Escherichiacoli,serotype 0111:B4,美國Sigma公司);DMEM培養基(美國Hyclone公司);DMSO(Sigma公司);RAW 264.7細胞株(北京大學醫學部細胞中心);IMDM培養基(CORNING公司);胰蛋白酶(CORNING公司,貨號:25-052-CI);胎牛血清(CORNING公司,貨號:35-076-CV);紅細胞裂解液(中科邁晨科技有限公司);zymosan(Sigma公司);MCO-18AIC(UV)型CO2細胞培養箱(三洋電機國際貿易有限公司);AE2000型倒置光學顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司);EnSpire型多功能酶標儀(美國PerkinElmer公司)。

SPF級C57BL/6雌性小鼠(質量合格證編號:No.110011201107276365)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號:SCXK-京2016-0006),飼養于潔凈動物房,室溫20～23 ℃,相對濕度45%～55%。本研究方案通過北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核(BUCM-4-2020052502-2005)。

白芷藥材于2019年12月購自河北安國藥材市場,經北京中醫藥大學史社坡研究員鑒定為傘形科植物杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根。

1.2 提取與分離

50 kg杭白芷,粉碎后加入6倍量95%乙醇浸泡過夜后,加熱回流提取兩次,每次3 h。藥渣再用6倍量70%乙醇提取3 h,將提取液合并濃縮,得白芷總浸膏4.2 kg。浸膏用水混懸,依次使用石油醚、乙酸乙酯進行萃取,減壓回收溶劑依次得到石油醚部位提取物450 g、乙酸乙酯部位提取物223 g、水部位提取物2 240 g。采用大孔樹脂對水部位萃取物以10%、20%、90%的乙醇梯度洗脫,分別得到水洗脫部位960 g、10%乙醇洗脫部位772 g、20%乙醇洗脫部位151 g、90%乙醇洗脫部位113 g。將113 g的90%乙醇洗脫部位經正相硅膠柱色譜(乙酸乙酯-甲醇10∶1→1∶1)梯度洗脫,合并得到4個流分Fr.A～D。Fr.A(33 g)采用硅膠柱色譜分離(石油醚-乙酸乙酯5∶1→1∶1,二氯甲烷-甲醇20∶1→1∶1)梯度洗脫,得到14個流分(Fr.A1～Fr.A14),Fr.A1(1.4 g)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,20∶80)得到化合物7(26 mg,tR= 35 min)。Fr.A3(5 g)經Sephadex LH-20(甲醇-二氯甲烷,1∶1)等度洗脫,得到流分Fr.A3a～Fr.A3g(230 mg),Fr.A3c(230 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,20∶80)得到化合物2(4 mg,tR= 32 min)和3(5.5 mg,tR= 36 min)。Fr.A3f(330 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,25∶75)得到化合物10(3 mg,tR= 16 min)。Fr.A6(4.3 g)經Sephadex LH-20(甲醇-二氯甲烷,1∶1)等度洗脫,得到7個流分(Fr.A6a～Fr.A6g),Fr.A6e(19 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,40∶60)得到化合物18(2.6 mg,tR= 8 min)和17(1.7 mg,tR= 10 min)。Fr.A6f(68 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,28∶72)得到化合物11(4.9 mg,tR= 12 min)、12(5.5 mg,tR= 16 min)、13(6.4 mg,tR= 18 min)和9(5.5 mg,tR= 26 min)。Fr.A9(5 g)經Sephadex LH-20,甲醇等度洗脫,得到流分Fr.A9a～Fr.A9c,Fr.A9b(230 mg)經反向ODS柱色譜分離(甲醇-水,10%→50%)梯度洗脫,得到4個流分(Fr.A9b1～Fr.A9b4),流分Fr.A9b2(43 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,27∶73)得到化合物5(3.7 mg,tR= 11 min)、14(5.4 mg,tR= 12.5 min)和4(4.9 mg,tR= 13 min)。Fr.A12(5 g)經反向ODS柱色譜分離,用(甲醇-水,30%→90%)梯度洗脫,得到流分Fr.A12a～Fr.A12d,Fr.A12b(47 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,20∶80)得到化合物16(1.8 mg,tR= 20 min)、8(7.9 mg,tR= 32 min)和6(9.5 mg,tR= 40 min)。Fr.A13(5 g)經反向ODS柱色譜分離,用(甲醇-水,30%→90%)梯度洗脫,得到4個流分(Fr.A13a～Fr.A13d),Fr.A13c(47 mg)經半制備HPLC分離純化(乙腈-水,38∶62)得到化合物1(7.4 mg,tR= 25 min)和15(1.7 mg,tR= 48 min)。

1.3 對Zymosan誘導的中性粒細胞釋放超氧化物的抑制活性篩選

C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死,用75%乙醇溶液浸泡小鼠5 min;取兩側股骨,用1 mL注射器吸取IMDM培養基沖洗出骨髓細胞,室溫300 g離心5 min,棄去上清;加5 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞,室溫300 g離心5 min,棄去上清;加入5 mL的IMDM清洗細胞,室溫300 g離心5 min,棄去上清;加入5 mL的IMDM重懸細胞,并進行細胞計數。將細胞稀釋到5×106個/mL,接種到96孔板中,100 μL/孔;IMDM對照組加IMDM,100 μL/孔;CO2培養箱孵育5 min。將96孔板各孔中加入超氧化物檢測試劑,20 μL/孔;再加入各化合物樣品溶液40 μL/孔,37 ℃孵育5 min。最后加入Zymosan溶液40 μL/孔,置于培育箱孵育,分別于45、90、180 min時檢測450 nm處的吸光度,并計算各化合物對誘導中性粒細胞超氧化物釋放的抑制率[6,7]。

1.4 對LPS-誘導的RAW 264.7細胞釋放NO的抑制活性篩選

將處于對數期的RAW 264.7細胞用胰酶消化,然后利用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基終止消化,并將細胞稀釋到3.5×105個/mL,接種到96孔板中,35 000細胞/孔,CO2培養箱孵育24 h。單體化合物配制成25 mmol/L或10 mmol/L濃度母液,然后用培養基稀釋后加入96孔培養板至終濃度為100、20、4 μmol/L,培養箱孵育1 h,再加入脂多糖(LPS)至終濃度為1 μg/mL,繼續孵育24 h。從96孔板各孔中吸取100 μL上清至酶標板內,每孔加入50 μL Griess R1,室溫避光放置5 min,再加入50 μL Griess R2,室溫避光放置5 min。540 nm測定吸光度。并計算各化合物對NO分泌的抑制率,抑制率>50%的計算半數抑制濃度(IC50)。在上述96孔板中加入10 μL的CCK8,CO2培養箱內孵育45 min后測定450 nm吸光度,并計算化合物對RAW 264.7細胞生長的抑制率[8]。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1白色無定型粉末;ESI-MS:m/z257[M+H]+,分子式為C15H12O4;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.66(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),7.31(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′/6′),6.78(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′/5′),6.45(1H,dd,J=8.8,1.2 Hz,H-6),6.28(1H,d,J=1.2 Hz,H-8),5.47(1H,dd,J=12.8,2.8 Hz,H-2),3.13(1H,dd,J=16.5,12.8 Hz,H-3b),2.67(1H,dd,J=16.5,2.8 Hz,H-3a);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:78.3(C-2),43.3(C-3),189.4(C-4),127.6(C-5),109.5(C-6),163.8(C-7),102.6(C-8),163.3(C-9),113.2(C-10),128.7(C-1′),128.2(C-2′),115.1(C-3′),157.6(C-4′),115.1(C-5′),128.2(C-6′)。以上數據與文獻[9]報道一致,故鑒定化合物1為甘草素。

化合物2白色無定型粉末;ESI-MS:m/z273[M+H]+,分子式為C15H12O5;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.30(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′/6′),6.79(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′/5′),5.87(2H,s,H-6/8),5.42(1H,dd,J=13.0,3.0 Hz,H-2),3.25(1H,dd,J=17.0,13.0 Hz,H-3b),2.66(1H,dd,J=17.0,3.0 Hz,H-3a);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:78.5(C-2),42.0(C-3),196.3(C-4),163.6(C-5),95.9(C-6),167.2(C-7),95.1(C-8),163.0(C-9),101.7(C-10),128.9(C-1′),128.4(C-2′),115.2(C-3′),157.8(C-4′),115.2(C-5′),128.4(C-6′)。以上數據與文獻[10]報道一致,故鑒定化合物2為柚皮素。

化合物3白色無定型粉末;ESI-MS:m/z287[M+H]+,分子式為C16H14O5;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:6.89～6.95(3H,overlap,H-2′,H-5′,H-6′),5.90(2H,d,J=2.2 Hz,H-6/8),5.32(1H,dd,J=12.6,3.1 Hz,H-2),3.86(3H,s,4′-OCH3),3.05(1H,dd,J=17.1,12.6 Hz,H-3b),2.73(1H,dd,J=17.1,3.1 Hz,H-3a);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:80.3(C-2),44.1(C-3),197.6(C-4),165.4(C-5),97.2(C-6),168.6(C-7),96.3(C-8),164.7(C-9),103.3(C-10),133.2(C-1′),114.5(C-2′),149.3(C-3′),147.8(C-4′),112.6(C-5′),119.0(C-6′),56.4(4′-OCH3)。以上數據與文獻[11]報道一致,故鑒定化合物3為橙皮素。

化合物4白色無定型粉末;ESI-MS:m/z435[M+H]+,分子式為C21H22O10;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:12.06(1H,s,5-OH),9.72(1H,s,4′-OH),7.33(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′/6′),6.80(1H,d,J=8.5 Hz,H-3′/5′),6.15(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.13(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),5.50(1H,dd,J=12.5,2.9 Hz,H-2),5.49(1H,d,J=12.5 Hz,2″-OH),5.40(1H,m,6″-OH),5.17(1H,d,J=5.0 Hz,3″-OH),5.10(1H,d,J=5.0 Hz,4″-OH),4.97(1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),3.66(1H,d,J=11.0 Hz,H-6″a),3.43(1H,dd,J=10.5,5.5 Hz,H-6″b),3.30(1H,dd,J=17.0,12.5 Hz,H-3b),3.11～3.18(4H,overlap,H-2″,H-3″,H-4″,H-5″),2.70(1H,dd,J=17.0,2.9 Hz,H-3a);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:78.8(C-2),42.2(C-3),197.4(C-4),163.1(C-5),96.6(C-6),165.4(C-7),95.6(C-8),162.9(C-9),103.4(C-10),140.2(C-1′),128.6(C-2′),115.3(C-3′),158.0(C-4′),115.3(C-5′),128.6(C-6′),99.7(C-1″),73.2(C-2″),76.5(C-3″),69.6(C-4″),77.2(C-5″),60.7(C-6″)。以上數據與文獻[12]報道一致,故鑒定化合物4為柚皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物5黃色粉末;ESI-MS:m/z465[M+H]+,分子式為C22H24O11;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.93(1H,d,J=9.0 Hz,H-5′),6.93(1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.89(1H,dd,J=9.0,1.8 Hz,H-6′),6.16(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.13(1H,d,J=2.4 Hz,H-6),5.49(1H,dd,J=13.0,2.5 Hz,H-2),4.97(1H,d,J=7.8 Hz,H-1″),3.77(3H,s,3′-OCH3),3.67(1H,dd,J=10.0,4.0 Hz,H-6″a),3.42(1H,m,H-6″b),3.38(1H,dd,J=17.2,13.0 Hz,H-3b),3.10～3.39(4H,overlap,H-2″,3″,4″,5″),2.76(1H,dd,J=17.2,2.5 Hz,H-3a);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:78.5(C-2),42.2(C-3),197.0(C-4),162.9(C-5),96.5(C-6),165.2(C-7),95.5(C-8),162.6(C-9),103.3(C-10),130.9(C-1′),114.1(C-2′),146.5(C-3′),148.0(C-4′),112.0(C-5′),117.8(C-6′),99.6(C-1″),73.0(C-2″),76.3(C-3″),69.5(C-4″),77.1(C-5″),60.6(C-6″),55.7(5′-OCH3)。以上數據與文獻[13]報道一致,故鑒定化合物5為橙皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6白色無定型粉末;ESI-MS:m/z581[M+H]+,分子式為C27H32O14;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.33(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′/6′),6.83(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′/5′),6.18(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.17(1H,d,J=2.2 Hz,H-6),5.37(1H,dd,J=11.6,2.7 Hz,H-2),5.26(1H,d,J=4.5 Hz,H-1″),5.10(1H,br s,H-1′′′),3.92(1H,d,J=13.5 Hz,H-6″a),3.86(1H,d,J= 8.5 Hz,H-6″b),3.33～3.96(8H,overlap,H-2″,H-3″,H-4″,H-5″,H-2′′′,H-3′′′,H-4′′′,H-5′′′),3.16(1H,dd,J=16.0,11.6 Hz,H-3b),2.74(1H,dd,J= 16.0,2.7 Hz,H-3a),1.30(3H,d,J=8.0 Hz,H-6′′′);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:80.7(C-2),44.0(C-3),198.5(C-4),166.5(C-5),98.0(C-6),166.6(C-7),96.7(C-8),164.6(C-9),105.0(C-10),130.8(C-1′),129.2(C-2′),116.4(C-3′),159.1(C-4′),116.4(C-5′),129.2(C-6′),102.5(C-1″),79.2(C-2″),78.9(C-3″),70.0(C-4″),78.1(C-5″),62.2(C-6″),99.3(C-1′′′),72.1(C-2′′′),71.2(C-3′′′),73.9(C-4′′′),69.6(C-5′′′),18.2(C-6′′′)。以上數據與文獻[14]報道一致,故鑒定化合物6為柚皮苷。

化合物7白色無定型粉末;ESI-MS:m/z611[M+H]+,分子式為C28H34O15;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:12.05(1H,s,5-OH),9.15(1H,s,3′-OH),6.93(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.89(1H,d,J=2.6 Hz,H-2′),6.87(1H,dd,J=8.4,2.6 Hz,H-6′),6.11(1H,br s,H-8),6.09(1H,br s,H-6),5.53(1H,br d,J=12.5 Hz,H-2),5.16(1H,d,J=8.0 Hz,H-1″),4.69(1H,d,J=2.0 Hz,H-1″′),3.77(3H,s,4′-OCH3),3.15～3.52(10H,overlap,H-2″,3″,4″,5″,6″,2″′,3″′,4″′,5″′),3.17(1H,dd,J=18.0,12.5 Hz,H-3b),2.78(1H,br d,J=18.0 Hz,H-3a),1.16(3H,d,J=6.0 Hz,H-6″′);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:78.5(C-2),42.2(C-3),197.1(C-4),163.0(C-5),96.3(C-6),164.9(C-7),95.2(C-8),162.6(C-9),103.4(C-10),131.0(C-1′),114.2(C-2′),146.5(C-3′),148.0(C-4′),112.0(C-5′),117.9(C-6′),100.4(C-1″),76.1(C-2″),77.2(C-3″),69.6(C-4″),77.0(C-5″),60.4(C-6″),97.4(C-1″′),70.3(C-2″′),70.5(C-3″′),71.9(C-4″′),68.3(C-5″′),18.1(C-6″′),55.7(4′-OCH3)。以上數據與文獻[15]報道一致,故鑒定化合物7為新橙皮苷。

化合物8黃色粉末;ESI-MS:m/z581[M+H]+,分子式為C27H32O14;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.27(2H,d,J=8.0 Hz,H-2′/6′),6.86(2H,d,J=8.0 Hz,H-3′/5′),6.23(1H,d,J=1.5 Hz,H-8),6.21(1H,d,J=1.5 Hz,H-6),5.43(1H,dd,J= 14.5,3.5 Hz,H-2),4.98(1H,t,J=7.5 Hz,H-1′′),4.73(1H,br s,H-1′′′),4.01(1H,d,J=13.0 Hz,H-6′′a),3.91(1H,d,J=10.5 Hz,H-6′′b),3.33～3.73(8H,overlap,H-2″,H-3″,H-4″,H-5″,H-2″′,H-3″′,H-4″′,H-5″′),3.20(1H,dd,J= 16.0,14.5 Hz,H-3b),2.79(1H,dd,J=16.0,3.5 Hz,H-3a),1.13(3H,d,J=6.0 Hz,H-6′′′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:80.6(C-2),44.1(C-3),198.5(C-4),164.5(C-5),98.0(C-6),166.9(C-7),97.1(C-8),164.5(C-9),105.0(C-10),129.1(C-1′),130.9(C-2′),116.4(C-3′),159.1(C-4′),116.4(C-5′),130.9(C-6′),101.7(C-1′′),74.7(C-2′′),77.9(C-3′′),71.3(C-4′′),77.1(C-5′′),67.4(C-6′′),102.1(C-1′′′),72.1(C-2′′′),72.4(C-3′′′),74.1(C-4′′′),69.8(C-5′′′),17.9(C-6′′′)。以上數據與文獻[16]報道一致,故鑒定化合物8為柚皮蕓香苷。

化合物9白色無定型粉末;ESI-MS:m/z581[M+H]+,分子式為C27H32O14;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.94(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.66(1H,dd,J=8.8,2.0 Hz,H-6′),7.16(1H,d,J=8.8 Hz,H-5′),5.50(1H,d,J=9.5 Hz,H-1″),4.02(3H,s,7-OCH3),3.90(3H,s,8-OCH3),3.85(3H,s,6-OCH3),3.84(3H,s,5-OCH3),3.82(3H,s,4′-OCH3),3.80(3H,s,3′-OCH3),3.56(2H,m,H-6″),3.08～3.56(4H,overlap,H-2″,3″,4″,5″);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:153.4(C-2),135.4(C-3),172.1(C-4),148.0(C-5),143.4(C-6),151.0(C-7),135.3(C-8),143.4(C-9),114.3(C-10),127.4(C-1′),121.3(C-2′),112.4(C-3′),147.3(C-4′),147.9(C-5′),111.4(C-6′),100.5(C-1″),69.8(C-2″),76.6(C-3″),74.3(C-4″),77.6(C-5″),60.6(C-6″),61.8(5-OCH3),61.9(6-OCH3),61.5(7-OCH3),61.4(8-OCH3),55.6(3′-OCH3),55.5(4′-OCH3)。以上數據與文獻[17]報道一致,故鑒定化合物9為3-羥基-5,6,7,8,3′,4′-六甲氧基黃酮醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10白色晶體(MeOH);ESI-MS:m/z363[M+H]+,分子式為C20H26O6;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.50(2H,m,H-2/3′),6.62(2H,d,J=1.5 Hz,H-5/5′),3.68(4H,br s,H-9/9′),3.68(6H,s,4-OCH3/4′-OCH3),2.44～2.54(4H,overlap,H-7a/7′a/7b/7′b),1.81(2H,m,H-8/8′);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:121.4(C-1,1′),115.3(C-2,2′),144.5(C-3,3′),147.5(C-4,4′),113.1(C-5,5′),132.4(C-6,6′),34.1(C-7,7′),42.7(C-8,8′),60.4(C-9,9′),55.6(4,4′-OCH3)。以上數據與文獻[18]報道一致,故鑒定化合物10為開環異落葉松脂醇。

化合物11白色粉末; +7.3(c0.1,MeOH);ESI-MS:m/z535[M+H]+,分子式為C27H34O11;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.91(2H,d,J=2.0 Hz,H-2/2′),6.90(2H,d,J=8.4 Hz,H-5/5′),6.85(2H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6/6′),5.10(1H,t,J=5.8 Hz,H-9′b),5.03(1H,br s,H-9′a),4.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-1″)4.66(1H,d,J=7.2 Hz,H-7′),4.64(1H,d,J=7.2 Hz,H-7),4.53(1H,t,J=5.8 Hz,H-9b),4.14(1H,m,H-9a),3.76(3H,s,4′-OCH3),3.74(3H,s,3′-OCH3),3.72(3H,s,4-OCH3),3.63(1H,dd,J=12.5,6.0 Hz,H-6″a),3.42(1H,dd,J=14.5,7.5 Hz,H-6″b),3.04(2H,m,H-8/8′),3.04～3.28(4H,overlap,H-2″,3″,4″,5″);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:135.2(C-1),110.5(C-2),148.8(C-3),145.9(C-4),115.1(C-5),118.2(C-6),85.0(C-7),53.7(C-8),71.0(C-9),133.8(C-1′),109.9(C-2′),148.8(C-3′),148.2(C-4′),111.6(C-5′),118.1(C-6′),84.9(C-7′),53.7(C-8′),71.0(C-9′),100.1(C-1″),73.2(C-2″),76.9(C-3″),69.7(C-4″),77.1(C-5″),60.7(C-6″),55.7(4-OCH3),55.5(3′-OCH3),55.6(4′-OCH3)。以上數據與文獻[19]報道一致,故鑒定化合物11為松脂素單甲基醚-β-D-葡萄糖苷。

化合物12無色針晶(MeOH); +43(c0.1,MeOH);ESI-MS:m/z535[M+H]+;分子式為C27H34O11;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.04(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.96(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),6.93(1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),6.92(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.85～6.89(2H,overlap,H-6/6′),5.12(1H,br s,H-9′b),5.04(1H,d,J=6.5 Hz,H-9′a),4.88(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),4.80(1H,d,J=6.0 Hz,H-7′),4.55(1H,d,J=5.5 Hz,H-9b),4.37(1H,d,J=6.8 Hz,H-7),4.10(1H,d,J=9.2 Hz,H-9a),3.77(3H,s,4′-OCH3),3.76(3H,s,3′-OCH3),3.74(3H,s,3-OCH3,),3.66(1H,dd,J=10.4,4.8 Hz,H-6″a),3.45(1H,dd,J=11.5,6.0 Hz,H-6″b),3.06～3.30(4H,overlap,H-2″,3″,4″,5″),2.83(1H,m,H-8);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:135.5(C-1),110.6(C-2),149.1(C-3),146.1(C-4),115.4(C-5),118.4(C-6),86.9(C-7),54.3(C-8),70.5(C-9),131.4(C-1′),109.6(C-2′),148.7(C-3′),147.8(C-4′),111.7(C-5′),117.8(C-6′),81.5(C-7′),49.6(C-8′),69.2(C-9′),100.3(C-1″),73.5(C-2″),77.3(C-3″),69.9(C-4″),77.1(C-5″),60.9(C-6″),55.9(4-OCH3),55.7(3′-OCH3),55.7(4′-OCH3)。以上數據與文獻[20]報道一致,故鑒定化合物12為連翹苷。

化合物13白色粉末;ESI-MS:m/z535[M+H]+,分子式為C27H34O11;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.99(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.84(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.78(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.67(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6′),6.66(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.62(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6),4.85(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),4.09(1H,t,J=7.6 Hz,H-9′a),3.88(1H,t,J=8.4 Hz,H-9′b),3.70(9H,s,3-OCH3/3′-OCH3/4′-OCH3),3.63(1H,dd,J=12.5,6.5 Hz,H-6″a),3.42(1H,dd,J=14.5,7.0 Hz,H-6″b),3.11～3.40(4H,overlap,H-2″,3″,4″,5″),2.81(1H,dd,J=13.2,4.4 Hz,H-7a),2.74(1H,dd,J=13.2,4.4 Hz,H-7b),2.55(1H,m,H-7′a),2.51(1H,m,H-8),2.47(1H,m,H-7′b),2.42(1H,m,H-8′);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:131.4(C-1),112.6(C-2),148.8(C-3),145.5(C-4),112.0(C-5),121.5(C-6),33.7(C-7),45.8(C-8),178.7(C-9),132.0(C-1′),114.0(C-2′),148.8(C-3′),147.5(C-4′),115.3(C-5′),120.6(C-6′),37.1(C-7′),41.0(C-8′),70.9(C-9′),100.4(C-1″),73.4(C-2″),77.2(C-3″),69.9(C-4″),77.1(C-5″),60.9(C-6″),55.6(4-OCH3),55.7(3′-OCH3),55.8(4′-OCH3)。以上數據與文獻[21]報道一致,故鑒定化合物13為牛蒡子苷。

化合物14白色粉末;ESI-MS:m/z521[M+H]+,分子式為C26H32O11;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.04(1H,d,J=8.5 Hz,H-5),6.95(1H,d,J=1.5 Hz,H-2),6.89(1H,d,J=4.0 Hz,H-5′),6.85(1H,dd,J=8.5,2.0 Hz,H-6),6.75(1H,dd,J=8.5,2.0 Hz,H-6′),6.72(1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),5.11(1H,d,J=4.0 Hz,H-9′b),5.04(1H,d,J=5.2 Hz,H-9′a),4.88(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′′),4.67(1H,d,J=4.0 Hz,H-7),4.61(1H,d,J=4.5 Hz,H-7′),4.55(1H,d,J=5.5 Hz,H-9b),4.12(1H,m,H-9a),3.77(3H,s,3-OCH3),3.76(3H,s,3′-OCH3),3.65(1H,m,H-6′′a),3.45(1H,m,H-6′′b),3.24～3.31(4H,overlap,H-2′′,3′′,4′′,5′′),3.04(2H,m,H-8/8′);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:135.2(C-1),110.6(C-2),145.9(C-3),147.5(C-4),115.2(C-5),118.7(C-6),85.2(C-7),53.7(C-8),71.0(C-9),132.2(C-1′),110.4(C-2′),145.8(C-3′),148.9(C-4′),115.1(C-5′),118.1(C-6′),84.9(C-7′),53.6(C-8′),70.9(C-9′),100.2(C-1′′),73.2(C-2′′),77.0(C-3′′),69.7(C-4′′),76.9(C-5′′),60.7(C-6′′),55.7(3-OCH3),55.6(3′-OCH3)。以上數據與文獻[22]報道一致,故鑒定化合物14為(-)-松脂醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物15無色膠狀;ESI-MS:m/z238[M+H]+,分子式為C12H15NO4;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:9.33(1H,s,CHO),7.15(1H,d,J=3.5 Hz,H-3),6.34(1H,d,J=3.5 Hz,H-4),5.22(1H,d,J=11.4 Hz,H-6),4.65(2H,s,H-11),4.34(1H,dd,J=8.0,5.5 Hz,H-8),2.66(1H,m,H-7),1.56(3H,d,J=5.0 Hz,H-9),1.14(3H,d,J=5.5 Hz,H-10);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:180.2(C-1),133.3(C-2),128.2(C-3),111.7(C-4),146.1(C-5),63.7(C-6),45.1(C-7),82.1(C-8),18.6(C-9),14.5(C-10),56.6(C-11),174.5(C-12)。以上數據與文獻[23]報道一致,故鑒定化合物15為金錢草堿。

化合物16無色膠狀;ESI-MS:m/z136[M+H]+,分子式為C5H5N5;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:12.75(lH,s,NH),8.09(2H,s,H-3/6),7.03(2H,s,NH);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:152.2(C-3/6),139.8(C-4/5),155.2(C-8)。以上數據與文獻[24]報道一致,故鑒定化合物16為1-H-咪唑并[4,5-d]噠嗪-2-胺。

化合物17無色膠狀;ESI-MS:m/z209[M+H]+,分子式為C11H12O4;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.48(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.04(1H,br s,H-2),7.00(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.27(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),4.15(2H,q,J=6.4 Hz,H-10),1.23(3H,t,J=6.4 Hz,H-11);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:125.5(C-1),114.0(C-2),145.0(C-3),148.4(C-4),115.7(C-5),121.4(C-6),145.6(C-7),114.8(C-8),166.5(C-9),59.7(C-10),14.3(C-11)。以上數據與文獻[25]報道一致,故鑒定化合物17為咖啡酸乙酯。

化合物18無色膠狀;ESI-MS:m/z136[M+H]+,分子式為C5H5N5;1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.48(1H,d,J=16.0 Hz,H-7),7.03(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),6.94(1H,br s,H-2),6.78(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.31(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),3.73(3H,s,H-10);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:126.5(C-1),115.0(C-2),145.6(C-3),148.7(C-4),115.4(C-5),122.3(C-6),145.3(C-7),114.7(C-8),166.5(C-9),52.0(C-10)。以上數據與文獻[26]報道一致,故鑒定化合物18為咖啡酸甲酯。

化合物1～18的結構見圖1。

圖1 化合物1～18的化學結構

2.2 活性測定

對上述18個化合物進行活性篩選,結果表明化合物3和18對zymosan誘導中性粒細胞釋放超氧化物具有一定的抑制作用,IC50為77.8±2.4 μmol/L,44.7±13.5 μmol/L(陽性對照藥為PLC inhibitor U73122,IC50為4.00±0.24 μmol/L)。化合物1和18具有抑制RAW 264.7細胞釋放NO活性,IC50分別為44.7±4.1、94.5±1.9 μmol/L(陽性對照吲哚美辛IC50為39.0±13.8 μmol/L)。

3 討論與結論

文獻中有關白芷化學成分的研究,普遍認為白芷中的化學成分主要為香豆素類成分,而關于白芷中非香豆素類成分的報道很少。Lu等[23]曾從白芷中分離鑒定出一個吡咯型生物堿金錢草堿,我們課題組在對白芷的系統研究中,除了分離得到大量的香豆素及香豆素二聚體外,也從白芷中分離得到16個吡咯生物堿[5],豐富了對白芷化學成分的認識。在對白芷化學成分的進一步研究中,意外地分離得到了本文中報道的18個非香豆素類成分,除前人已經報道的金錢草堿外,其他17個非香豆素類成分包括9個黃酮、5個木脂素、2個簡單酚酸酯和1-H-咪唑并[4,5-d]噠嗪-2-胺均為首次從白芷中分離得到。其中化合物3和18對zymosan誘導中性粒細胞釋放超氧化物具有一定的抑制作用,化合物1和18具有抑制RAW 264.7細胞釋放NO活性。值得注意的是,雖然已有多篇文獻報道白芷中含有黃酮類成分[3],但均是對總黃酮類成分含量測定的初步報道,目前尚無任何文獻從白芷中分離出單體黃酮類成分的報道,而本研究中從白芷中首次得到多個黃酮及黃酮苷單體,這種結果令我們感到非常意外,曾懷疑是否是藥材的問題,但進一步利用LC-MS對杭白芷、川白芷、禹白芷三個不同產地的白芷藥材進行初步分析,發現不同產地的白芷中能夠檢出本文中分離報道的化合物1、6、7和8,這說明白芷中確實可能含有黃酮。該研究結果豐富了對白芷化學成分的認識,為白芷質量控制和開發利用提供重要參考。