海洋真菌Aspergillus terreus次生代謝產物研究

李思敏,周金彩,何 蓉,唐穎楠,周思倩,王雅靜,龍紅萍*

1湖南科技職業學院藥學院,長沙 410004;2湖南中醫藥大學第一附屬醫院,長沙 410007;3湖南中醫藥大學,長沙 410208

近年來,海洋天然產物吸引了全世界的化學家和生物學家的關注,目前已從海洋生物中分離鑒定出1.6萬多種海洋天然產物,海洋微生物被認為是生產新型抗生素、抗腫瘤和抗炎藥物的寶貴來源[1]。海洋真菌特別是與海洋藻類、海綿、無脊椎動物和沉積物相關的真菌是生物活性次代謝產物的有效生成者,由于它們在溫度、營養物質、競爭和鹽度等方面的特性,與陸生真菌相比形成了特定的次級代謝途徑,能產生豐富的新活性天然產物[2],這些新穎結構次生代謝物在藥物發現過程中發揮著重要作用[3,4]。

曲霉屬真菌是地球上分布最廣泛的真菌群之一,包含約300～350多種真菌[5]。目前從曲霉屬真菌中發現了多種結構類型的次生代謝產物,如生物堿類、萜類、木質素類、甾體、聚酮類、環肽類等,且具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多種生物活性[6]。土曲霉廣泛存在于自然界中,常被從土壤的根際[7]、腐爛的有機物[8]和海洋環境[9]中分離出來,除能夠產生降脂藥洛伐他汀及其中間體外,土曲霉還能產生多種具有經濟意義的次生代謝物。同一種菌,因來源不同,所處環境不同,其次生代謝產物亦不相同。本研究選取來源于南沙群島海域海泥中分離得到的一株土曲霉為研究對象,并采用大米固體培養基進行大規模發酵,對其次生代謝產物進行分離純化和結構鑒定,并進行低氧/復氧誘導的PC12細胞損傷的體外神經保護活性評價,以期發現結構新穎和活性較好的代謝產物,進一步豐富曲霉屬真菌的次生代謝產物。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

質譜數據由Agilent 6500 Q-TOF質譜儀測定(美國安捷倫科技有限公司);旋光數據由Autopol II型自動旋光儀測定(美國魯道夫公司);核磁數據由Bruker AV-500 MHz和AV-600 MHz核磁共振儀測定(美國布魯克儀器有限公司),以TMS作為內標;分析型HPLC為Agilent 1260(美國安捷倫科技有限公司);制備型HPLC為EClassical P3500(大連依利特儀器有限公司);LDZM-60L高壓滅菌鍋(上海申安儀器有限公司);Enspire多功能酶標儀(美國珀金埃爾默儀器有限公司);IX71熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);LSM800激光共聚焦(德國卡爾·蔡司有限公司);Sephadex LH-20凝膠(瑞典法瑪西亞公司);D101大孔吸附樹脂(天津浩聚樹脂有限公司);柱層析硅膠200～300目(青島海洋化工廠);HS-GF254薄層層析硅膠板(煙臺江有硅膠開發有限公司);PC12細胞(批號:CL-0481,武漢普諾賽生命科技有限公司);RPMI 1640培養基(批號:61870036,美國賽默飛世爾科技有限公司,);Gibco胎牛血清(批號:10100147,美國賽默飛世爾科技有限公司);CCK-8試劑盒(批號:BA00208,北京博奧森生物技術有限公司);胰酶(批號:25200114,美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 菌種來源

菌株土曲霉是從中國南沙群島海域海泥中分離純化得到,其DNA擴增和ITS序列由北京擎科生物科技有限公司測定,并經過BLAST對比,發現與菌株Aspergillusterreus(Genbank accession No.MF152908.1)的18S rRNA序列和ITS序列99.31%相似,結合形態學特征,將該菌株鑒定為土曲霉,并保藏于湖南中醫藥大學附屬第一醫院醫學創新實驗中心(編號:CXJ-38)。

1.3 菌種的發酵與提取分離

將目標菌株接種到PDA平板上活化,室溫下培養5～7 d,活化的真菌用刀片切取適量接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中,在室溫和150 r/min培養5 d后作為種子液。取500 mL錐形瓶50個,每瓶裝100 g大米和100 mL水,于121 ℃滅菌30 min作為固體發酵培養基。向每瓶固體培養基中加入10 mL種子液,室溫下,靜置避光培養30 d。

固體發酵物用乙酸乙酯提取3次,減壓濃縮得浸膏71 g。浸膏用大孔吸附樹脂(D101)分段,分別用水、80%甲醇水、甲醇洗脫。80%甲醇水洗脫部位進一步用硅膠柱分離,分別用石油醚-乙酸乙酯-甲醇洗脫(10∶1∶0、7∶1∶0、5∶1∶0、2∶1∶0、1∶1∶0、1∶1∶0.2),合并后得10個組分(Fr.A～J)。組分Fr.D 通過凝膠柱色譜和半制備液相(40%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min)純化得到化合物5(5.2 mg,tR=18.8 min)、6(3.8 mg,tR=21.2 min)、7(4.5 mg,tR= 24.0 min)和13(3.6 mg,tR= 25.7 min)。組分Fr.E通過凝膠柱色譜和半制備液相(25%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min,進樣量為0.1 mL,檢測器為VWD,檢測波長為254 nm)純化得到化合物10(2.5 mg,tR=10.6 min)、11(3.0 mg,tR=11.6 min)、12(3.5 mg,tR=13.0 min)。組分Fr.F 通過凝膠柱色譜和半制備液相(35%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min,進樣量為0.1 mL,檢測器為VWD,檢測波長為254 nm)純化得到化合物1(3.5 mg,tR=18.6 min)、3(3.2 mg,tR=23.8 min)和8(4.3 mg,tR=26.9 min)。組分Fr.G 通過凝膠柱色譜和半制備液相(30%甲醇水等度洗脫,流速3 mL/min,進樣量為0.1 mL,檢測器為VWD,檢測波長為254 nm)純化得到化合物2(3.3 mg,tR=19.2 min)、4(2.8 mg,tR=20.5 min)和9(3.6 mg,tR=25.4 min)。

1.4 神經保護活性評價

對化合物1～13進行低氧/復氧誘導的PC12細胞損傷保護作用的活性評價,取PC12細胞,在37 ℃、1640培養液、5% CO2培養箱中適應性培養,接種于24孔板中,培養24 h。將PC12細胞進行低氧/復氧處理后(缺氧3 h后,復氧同時給藥干預24 h,給藥劑量為1 μmol/L和0.1 μmol/L)。PBS輕輕潤洗2次,每孔加入細胞固定液0.3 mL,室溫固定細胞45 min。棄液,用PBS洗2次,每孔加入0.25%Triton-100液0.2 mL,室溫處理10 min。棄液,用PBS洗2次,每孔加入0.2 mL Hoechst染色液(1∶400),室溫浸染細胞15 min。棄液,PBS洗滌細胞3次,于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。通過CCK-8法檢測細胞存活率,向每孔加入10 μL CCK-8溶液,混合均勻,在37 ℃孵育3 h,采用酶標儀檢測各組細胞在450 nm下的吸光度。

1.5 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據處理,采用t檢驗確定顯著性水平,若P<0.05則具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物3白色粉末;HR-ESI-MS:m/z383.146 8[M+H]+,分子式為C22H22O6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.45(2H,d,J=8.8 Hz,H-2′/H-6′),6.93(1H,d,J=8.3 Hz,H-6′′),6.92(1H,s,H-2′′),6.79(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′/H-5′),6.65(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′′),6.51(1H,s,H-4),3.75(2H,s,H-5),3.72(1H,dd,J= 7.3,5.4 Hz,H-8′′),2.92,(1H,dd,J=16.6,5.4 Hz,Ha-7′′),2.64(1H,dd,J=16.6,7.2 Hz,Hb-7′′),1.29(3H,s,H-10′′),1.22(3H,s,H-11′′);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:175.3(s,C-1),125.3(s,C-2),158.5(s,C-3),100.0(d,C-4),30.1(t,C-5),122.6(s,C-1′),131.7(d,C-2′/C-6′),117.0(d,C-3′/C-5′),162.2(s,C-4′),130.6(s,C-1′′),130.3(d,C-2′′),121.4(s,C-3′′),152.9(s,C-4′′),118.1(d,C-5′′),128.3(d,C-6′′),32.1(t,C-7′′),70.5(d,C-8′′),77.9(s,C-9′′),25.8(q,C-10′′),21.1(q,C-11′′)。以上數據與文獻[12]報道基本一致,其旋光值為零,推測為外消旋體,因此鑒定化合物為(±)-asperteretal F。

化合物4白色粉末;HR-ESI-MS:m/z365.164 3[M+H]+,分子式為C22H22NO4;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:7.42(2H,d,J=8.7 Hz,H-2′/H-6′),6.83(1H,s,H-2′′),6.82(2H,d,J=8.7 Hz,H-3′/H-5′),6.81(1H,d,J=7.5 Hz,H-6′′),6.65(1H,d,J=7.7 Hz,H-5′′),5.24(1H,m,H-8′′),3.76(2H,s,H-6),3.20(1H,d,J=7.4 Hz,H-7′′),1.71(3H,s,H-10′′),1.65(3H,s,H-11′′);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:174.1(s,C-2),139.4(s,C-3),138.4(s,C-4),174.8(s,C-5),29.5(t,C-6),121.5(s,C-1′),132.4(d,C-2′/C-6′),116.4(d,C-3′/C-5′),160.4(s,C-4′),129.6(s,C-1′′),130.3(d,C-2′′),129.4(s,C-3′′),154.7(s,C-4′′),115.9(d,C-5′′),127.5(d,C-6′′),28.9(t,C-7′′),123.7(d,C-8′′),133.3(s,C-9′′),17.8(q,C-10′′),25.9(q,C-11′′)。以上數據與文獻[13]報道基本一致,因此鑒定化合物為asperimide A。

化合物5白色粉末;HR-ESI-MS:m/z405.263 0[M+H]+,分子式為C24H36O5;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.97(1H,d,J= 9.6 Hz,H-4),5.76(1H,dd,J=9.6,6.0 Hz,H-3),5.51(1H,br s,H-5),5.36(1H,br d,J=3.4 Hz,H-8),4.61(1H,m,H-11),4.35(1H,m,H-13),2.72(1H,dd,J= 17.7,5.2 Hz,Hb-14),3.20(1H,d,J=17.7 Hz,Ha-14),2.44(1H,m,H-6),2.35(2H,m,overlapped,H-2/H-2′),2.25(1H,br d,J=12.3 Hz,H-8a),1.81～1.97(4H,m,overlapped,Hb-10,Hb-12,Ha-7,Hb-7),1.61～1.71(3H,m,overlapped,Hb-3′,H-1,Ha-12),1.34～1.51(3H,m,overlapped,Ha-9,Hb-9,Ha-3′),1.27(3H,m,Ha-10),1.09(3H,d,J=6.9 Hz,2′-CH3),1.06(3H,d,J=7.4 Hz,6-CH3),0.88(3H,d,J= 7.0 Hz,2-CH3),0.87(3H,t,J=7.5 Hz,H-4′);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:36.7(d,C-1),30.8(d,C-2),14.0(q,2-CH3),133.2(d,C-3),128.4(d,C-4),131.7(s,C-4a),129.8(d,C-5),27.6(d,C-6),23.0(q,6-CH3),32.8(t,C-7),68.0(d,C-8),37.4(d,C-8a),24.4(t,C-9),33.1(t,C-10),76.5(d,C-11),36.2(t,C-12),62.7(d,C-13),38.7(t,C-14),170.7(s,C-15),177.1(s,C-1′),41.6(d,C-2′),26.9(t,C-3′),11.9(q,C-4′),16.4(q,2′-CH3)。以上數據與文獻[14]報道基本一致,因此鑒定化合物為洛伐他汀。

化合物6白色粉末;HR-ESI-MS:m/z489.211 0[M+H]+,分子式為C26H32O9;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.15(1H,s,6-OH),5.46(1H,s,Ha-22),5.08(1H,s,Hb-22),3.79(3H,s,H-1′),3.54(1H,s,H-14),2.95(1H,br d,J=13.9 Hz,Ha-11),2.69(1H,dd,J=19.1,8.5 Hz,Ha-2),2.52(1H,m,Hb-2),2.35(1H,m,Ha-1),2.26(1H,br d,J=14.4 Hz,Hb-11),1.93(3H,s,H-20),1.76(1H,m,Hb-1),1.71(3H,s,H-24),1.47(3H,s,H-23),1.47(3H,s,H-18),1.44(3H,s,H-19),1.21(3H,s,H-21);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:28.0(t,C-1),32.6(t,C-2),214.1(s,C-3),47.8(s,C-4),131.5(s,C-5),138.6(s,C-6),196.9(s,C-7),52.3(s,C-8),77.5(s,C-9),43.0(s,C-10),34.8(t,C-11),139.7(s,C-12),49.4(s,C-13),44.5(d,C-14),167.7(s,C-15),85.4(s,C-16),201.4(s,C-17),21.1(q,C-18),23.5(q,C-19),19.7(q,C-20),18.5(q,C-21),117.1(t,C-22),23.3(q,C-23),21.2(q,C-24),168.5(s,C-25),53.7(q,25-OCH3)。以上數據與文獻[15]報道基本一致,因此鑒定化合物為terretonin。

化合物7白色粉末;HR-ESI-MS:m/z466.160 5[M+H]+,分子式為C24H23N3O7;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:9.23(1H,s,H-2′),8.83(1H,d,J=8.4 Hz,H-3),8.71(1H,d,J=3.9 Hz,H-4′),8.26(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),7.91(1H,d,J=7.8 Hz,H-6),7.61(1H,m,H-4),7.38(1H,dd,J= 7.8,4.7 Hz,H-5′),7.28(1H,s,H-6′′),7.24(1H,m,H-5),3.98(3H,s,4′′-OCH3),3.92(3H,s,3′′-OCH3),3.91(3H,s,5′′-OCH3),3.83(3H,s,7′′-OCH3);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:120.1(s,C-1),140.1(s,C-2),121.5(d,C-3),133.4(d,C-4),123.6(d,C-5),127.7(d,C-6),168.0(s,C-7),130.4(s,C-1′),149.0(d,C-2′),152.3(d,C-4′),123.4(d,C-5′),135.0(d,C-6′),163.8(s,C-7′),118.8(s,C-1′′),125.5(s,C-2′′),148.6(s,C-3′′),146.6(s,C-4′′),151.2(s,C-5′′),108.5(d,C-6′′),167.0(s,C-7′′),61.0(q,3′′-OCH3),61.0(q,4′′-OCH3),56.2(q,5′′-OCH3),52.5(q,7′′-OCH3)。以上數據與文獻[16]報道基本一致,因此鑒定化合物為methyl-3,4,5-trimethoxyl-2-(2-(nicotinamide)benzamido) benzoate。

化合物1～13的化學結構見圖1。

圖1 化合物1～13的化學結構

2.2 活性評價結果

化合物1～13對低氧/復氧誘導的PC12細胞損傷的保護作用活性評價結果顯示,與模型組相比,當藥物濃度為1 μmol/L和0.1 μmol/L,化合物1、3、5、6和7能顯著降低細胞凋亡率和提高細胞存活率,化合物8、12和13具有明顯地抑制細胞生長和促使其凋亡的作用,均具有統計學意義(P<0.01);化合物2、9和11未表現出對細胞生長和凋亡的影響,無顯著性差異(見圖2和圖3)。土曲霉次生代謝產物1、3、5、6和7能顯著減少氧化應激產生的細胞損傷,呈現出一定的神經保護的活性。

圖2 不同濃度化合物1～13對OGD/R處理的PC12細胞活力的影響

圖3 不同濃度化合物1～13對OGD/R處理的PC12細胞凋亡的影響

3 結論

本研究利用大孔吸附樹脂、硅膠、凝膠柱色譜及半制備液相等方法對海洋來源土曲霉的次生代謝產物進行了分離純化,從中分離鑒定出13個化合物,其中化合物1～3是γ-丁內酯衍生物,化合物4是一類海洋天然生物堿馬來酰亞胺(2,5-吡咯二酮)衍生物,化合物5是他汀類藥物洛伐他汀,化合物6是萜類化合物,化合物7是苯甲酸甲酯類化合物,首次報道了它的核磁數據,化合物8～12是5個二酮哌嗪類化合物,其中化合物8和9為硫代二酮哌嗪,化合物13是苯并吡喃酮類化合物。初步的體外神經保護活性測試表明化合物1、3、5、6和7能顯著減少氧化應激產生的細胞損傷,本文研究了土曲霉大米發酵物的次生代謝產物及單體化合物的神經保護活性,為后期深入挖掘土曲霉次生代謝產物的化學多樣性提供了科學參考依據。