光質對等鞭金藻的生長和生物活性產物合成的影響

鐘彩榮,陳欽常,許涵玥,曾子航,徐紹絲,車丹丹,2,方靜平*,何勇錦,2*

1福建師范大學生命科學學院;2福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心,福州 350117

海洋微藻是一種多功能型的細胞工廠,可合成色素、多糖、多不飽和脂肪酸PUFAs等多種活性產物,廣泛應用于食品、醫藥、飼料、化妝品等領域[1]。在眾多的海洋微藻藻種中,等鞭金藻(Isochrysis)具有生長快、光合效率高、巖藻黃素與多不飽和脂肪酸(PUFAs,如十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸)合成能力強、無細胞壁結構等優點,受到科技工作者和微藻企業家的關注,已應用于開發意大利面、餅干、酸奶等功能性食品[2]。有研究報道,巖藻黃素被證實具有抗炎、抗肥胖、抗癌、抗菌、神經保護、促進軸突生長、改善代謝、治療呼吸道疾病等多種藥理作用[3];多不飽和脂肪酸也能改善糖尿病、骨質疏松癥[4];胞外多糖能促進新陳代謝,增強機體免疫力。因此,利用等鞭金藻開發巖藻黃素和多不飽和脂肪酸應用于食品具有重要的意義。

光質是影響光合自養微藻細胞生長和產物合成的重要因素之一[5]。不同的光質擁有不同的光量子通量密度、光譜波長等特性,影響光合自養微藻細胞的光合作用效率和固碳性能,表現出細胞生長性能和產物合成的差異[6]。對于等鞭金藻藻種,已有研究表明不同來源的等鞭金藻藻種對光質的選擇存在較大差異性[7,8]。例如,Che等[9]研究發現,等鞭金藻先用(來源韓國海洋微藻培養中心)混合光(藍光和紅光)培養再綠光培養可獲得最高的油脂含量(62.5%)。Bu等[10]研究表明,湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)在紅光條件下表現最高的生長速率;但是,綠光培養的微藻細胞具有最高的葉綠素含量。值得注意的是,關于光質影響等鞭金藻合成生物活性產物的研究中,科技工作者僅僅關注光質對等鞭金藻細胞某一種活性產物合成的影響。然而,正如上文所述,等鞭金藻會合成巖藻黃素和多不飽和脂肪酸活性物質。基于此,需要通過研究工作篩選出一種合適的光質,實現等鞭金藻協同合成巖藻黃素和多不飽和脂肪酸的平衡,使藻細胞最大化合成其活性物質。

本課題組前期研究表明,在中試規模柱式光反應器(50 L)下,采用半連續培養方式(培養過程補充氮源和磷酸)養殖等鞭金藻(Isochrysissp.ISO-FJ)可獲得可持續再生的油脂和巖藻黃素[11]。因此,本研究選擇等鞭金藻(Isochrysissp.ISO-FJ)為出發藻株,研究三種光質(白光、紅光和綠光)對等鞭金藻協同合成巖藻黃素和多不飽和脂肪酸性能的影響,為中試調控等鞭金藻生長和活性產物合成提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITYUPLC超高液相色譜儀(新加坡沃特斯公司);SCION-436氣相色譜儀(天美儀拓實驗室設備(上海)有限公司,型號:SCION-GC436,Burker);UV-9600分光光度計(科遠貿易有限公司);BS224S電子秤(北京賽多利斯系統儀器有限公司);H1650-W湘儀離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

二水合乙二胺四乙酸二鈉(國藥集團化學試劑有限公司,純度≥99.0%,批號:20230424);三氯甲烷(昆山金城試劑有限公司,純度≥99.0%,批號:20201021);硝酸鈉、濃硫酸、維生素H、維生素B12、維生素B1己烷(國藥集團化學試劑有限公司,純度≥99.5%);二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、苯酚、甲醇(西隴科學股份有限公司,純度≥99.0%);乙腈、色譜級甲醇(上海麥克林生化科技有限公司,純度≥99.9%)。

1.2 藻種和培養基

等鞭金藻藻種(Isochrysissp.ISO-FJ)保存于本實驗室,由福清市新大澤螺旋藻有限公司董事長鄭行捐贈。

培養等鞭金藻的培養基為改良后的f/2培養基,組成成分:300 mg/L硝酸鈉,22 mg/L磷酸二氫鈉合水,2.50 × 103mg/L海鹽,12.60 mg/L氯化亞鐵,17.44 mg/L二水合乙二胺四乙酸二鈉,6.92 × 10-3mg/L五水硫酸銅,2.52 × 10-3mg/L鉬酸鈉,8.80 × 10-3mg/L七水硫酸鋅,4.00 × 10-3mg/L六水合氯化鈷,0.07 mg/L四水氯化錳,0.80 mg/L維生素B1,4.00 × 10-3mg/L維生素H,4.00 × 10-3mg/L維生素B12。

1.3 等鞭金藻的培養

將等鞭金藻細胞接入改良后的f/2培養基中,使用LED白光(400～700 nm)、紅光(620～650 nm)和綠光(500～580 nm)對其進行持續光照培養,藻細胞初始為3.00 × 106個/mL,通入1 L/min的空氣。光照強度為45 μmol/(m2·s),培養溫度為23±1 ℃,培養周期為15 d。

1.4 測定方法

1.4.1 生物量的測定

每隔3 d取10 mL的藻液,用分光光度計在680 nm處測量藻液的OD值并根據標準曲線計數出等鞭金藻的細胞數。等鞭金藻的細胞個數與其OD值的關系:Y=163.52×104X-3.06(R2=0.999),其中Y(個/mL)為等鞭金藻細胞數,X為在680 nm處的OD值。

1.4.2 硝酸氮濃度的測定

采用紫外分光光度法測定硝酸氮的濃度。以硝酸鉀制作標準曲線,計算溶液中硝酸氮濃度。硝酸氮含量標準曲線為:N=3.14(A220-2A275)+0.01(R2=0.999),其中A220為220 nm處的OD值,A275為275 nm處的OD值,N(mg/L)為硝酸氮濃度。

1.4.3 巖藻黃素的測定

取150 mL的藻液離心并凍干48 h,向凍干的藻粉中加入5 mL的甲醇,搖勻,避光提取1 h,取上清液過0.22 μm的有機濾膜,采用UPLC檢測巖藻黃素。流動相流速:0.25 mL/min。色譜柱溫度:40 ℃。樣品室溫度:25 ℃。進樣量:2 μL。進樣時間:12 min。配置好濃度梯度為0、20、40、60、80、100 mg/L的巖藻黃素標準品溶液。通過標準曲線計算巖藻黃素的含量。巖藻黃素標準曲線:F=56 942z+160 887(R2=0.999),其中,F表示峰面積,其中z(mg/L)表示巖藻黃素的含量。

1.4.4 蛋白質、糖類、油脂和脂肪酸組成的測定

采用BCA法[12]測定等鞭金藻的蛋白質含量,硫酸-苯酚法[13]測定等鞭金藻的多糖含量,采用氯仿-甲醇法[14]測定等鞭金藻油脂含量。

通過氣相色譜儀測定脂肪酸含量[14];載氣為高純度氦氣,檢測器溫度為260 ℃,注射口溫度為250 ℃,分流比為1∶40,進樣量為1 μL。

1.5 數據處理

所有實驗設置三個平行。使用Excel和GraphPad Prism 8.0軟件處理數據和作圖,采用SPSS 17.0進行顯著性分析,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同光質對等鞭金藻細胞生長和硝酸氮消耗的影響

等鞭金藻細胞分別在白、紅和綠光下的生長情況如圖1A。由圖1A可知,培養結束后,紅光組的等鞭金藻細胞數最低(8.42 × 106個/mL),白光組的藻細胞數最高(1.41 × 107個/mL)(見圖1A)。Mao等[15]研究發現,等鞭金藻的最大光譜吸收峰為450～500 nm,同時在550～650 nm有一個較小的吸收峰。在本研究中,三種光質中只有白光的光譜范圍包含了450～500 nm的光譜。因此,由圖1A的結果可得,在三種光質中,白光是最有利于等鞭金藻細胞生長的光質。

圖1 不同光質對等鞭金藻細胞生長(A)和硝酸氮消耗(B)的影響

有研究表明,不同光質條件下,藻細胞會影響硝酸氮的吸收,進而呈現明顯差異的細胞生長特性[8]。圖1B呈現不同光質影響等鞭金藻細胞吸收硝酸氮的結果。由圖1B可得,在等鞭金藻培養過程中,三種光質中的硝酸氮濃度都呈現遞減趨勢(見圖1B)。與其他組相比,白光組的藻細胞更有利于硝酸氮的吸收,導致殘留硝酸氮最低。該實驗結果與前人研究相似。例如,Gan[16]發現白光組的小球藻比紅光組更有利于氮元素的吸收。

2.2 不同光質對等鞭金藻蛋白質、胞內多糖和油脂合成的影響

在白、紅和綠光下的等鞭金藻蛋白質含量如圖2A所示。在培養過程中,三種光質中的蛋白質含量都呈現遞減趨勢。培養結束后,紅光和綠光組的等鞭金藻蛋白質含量明顯高于白光組的結果。這結果表明紅光和綠光更有利于等鞭金藻蛋白質的積累。此結果與Gong等[17]發現紅光與綠光比白光更有利于石莼蛋白質積累的結果相吻合。但與Huang[18]發現白光更有利于紫球藻中蛋白質的積累存在差異。光質對于微藻的影響存在物種特異性,每種微藻在不同的照明條件下都會有適合其生長的最佳光質,推測出現兩種完全相反的結果是因為藻種和培養條件不同造成的。

圖2 不同光質對等鞭金藻蛋白質(A)、胞內多糖(B)和油脂(C)合成的影響

如圖2B所示,在培養過程中,白、紅、綠光組的等鞭金藻胞內多糖含量先增加后降低。培養結束時,紅光組的等鞭金藻胞內多糖含量高(5.81 pg/cell),其次為綠光(5.16 pg/cell),白光組最低(4.98 pg/cell)。已有的研究表明[19],與綠光和白光相比,微藻細胞在紅光條件下表現出更強的糖類合成。這可能是紅光比綠光和白光更能提高光能捕獲效率,可促進微藻光合利用固碳,進而積累糖類化合物。

白光、紅光和綠光下等鞭金藻細胞的油脂含量隨培養時間的變化如圖2C所示,三種光質下等鞭金藻油脂含量呈遞增趨勢。微藻油脂合成途徑中關鍵酶的活性與培養體系中的氮濃度呈負相關關系。本實驗中,隨著培養時間的延長,三種光質下的硝酸氮濃度逐漸下降(見圖1B),有利于增強等鞭金藻細胞內油脂代謝中關鍵酶(如溶血磷脂酸酰基轉移酶LAT、二酰甘油酰基轉移酶DGAT)的活力,進而提高細胞內油脂含量。培養結束時,綠光組的等鞭金藻油脂含量最高(20 pg/cell),其次為紅光組(16.51 pg/cell),白光組油脂含量最低(16.26 pg/cell)。Helamieh等[20]證實了綠光比紅光更有利于柵藻中油脂的積累。前人研究表明[21],在缺氮的情況下,微藻將蛋白質和糖分解并優先合成油脂,但在本研究中蛋白質和胞內多糖降低,是不是因為被降解合成油脂需要進一步深入研究。

2.3 不同光質對等鞭金藻巖藻黃素、胞外多糖、SDA、DHA、PUFAs合成的影響

如圖3所示,巖藻黃素標準品和從等鞭金藻中提取的巖藻黃素樣品出峰時間皆為3.219 min,可初步證明從等鞭金藻中提取的物質為巖藻黃素。如圖4所示,三種光質中,等鞭金藻巖藻黃素含量先上升后下降,在第6 d時達到最大值,此時綠光組巖藻黃素含量最高(0.78 pg/cell),白光組次之(0.69 pg/cell),紅光組最低(0.66 pg/cell)。Fujita等[22]的研究也表明,綠光能促進三角褐指藻中巖藻黃素合成。巖藻黃素主要與葉綠素a結合形成巖藻黃素-葉綠素蛋白復合體(FCP),FCP可以捕獲綠色區域的光能[23],為巖藻黃素的合成提供充足能量。此外,相對于綠光,紅光和白光釋放更多的光子,形成更高的PPFD/W比值[24],(PPFD:光合光子通量密度;PPFD/W:表示消耗一瓦電所產生的PPFD)促進等鞭金藻光合作用,產生更多的活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起巖藻黃素的氧化(見圖5),使其巖藻黃素的含量降低。由圖4A的結果可知,綠光比紅光和白光更有利于等鞭金藻巖藻黃素的積累。

圖3 巖藻黃素標準品(A)和等鞭金藻提取的巖藻黃素樣品(B)色譜圖

圖4 不同光質對等鞭金藻巖藻黃素(A)、胞外多糖(B)、十八碳四烯酸(C)、二十二碳六烯酸(D)和多不飽和脂肪酸(E)的影響

圖5 等鞭金藻生物活性物質合成途徑

等鞭金藻胞外多糖在白、紅和綠光中的合成情況如圖4B所示。由圖可知,等鞭金藻在三種光質條件下所合成的胞外多糖呈上升趨勢。在整個培養過程中,綠光最有利于等鞭金藻胞外多糖的積累,培養結束時其含量為88.84 mg/L;紅光次之,為75.71 mg/L;白光最次,為66.20 mg/L。這些結果表明,綠光比紅光和白光更有利于等鞭金藻胞外多糖的積累。

如圖4C～4E所示,等鞭金藻十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸和多不飽和脂肪酸在白光、紅光和綠光條件下都呈遞增趨勢,其中綠光最有利于多不飽和脂肪酸的合成。培養結束時,綠光下的藻細胞的十八碳四烯酸、二十二碳六烯酸和多不飽和脂肪酸最大含量分別為0.74、0.21和1.32 pg/cell。已有的研究表明,微藻細胞的油脂代謝中關鍵酶(如脂肪酸合成酶、脫氫酶等)的表達和活性與其所培養的光質存在相關性。本研究中,等鞭金藻在綠光條件下可能有利于油脂代謝中這些關鍵酶的活性,促進胞內油脂及其長鏈多不飽和脂肪酸的合成(見圖5)。

3 結論

本實驗探究了白光(400～700 nm)、紅光(620～650 nm)和綠光(500～580 nm)三種不同光質對等鞭金藻的生長和生物活性產物積累的影響。實驗結果發現,不同光質會明顯影響等鞭金藻的生長和生物活性產物的協同合成。在微藻細胞生長方面,與紅光和綠光組相比,采用白光培養等鞭金藻更有利于藻細胞的生長和硝酸氮營養物質的吸收。在生物活性物質合成方面,在所選擇三種光質中,藻細胞在綠光條件下可合成最大的巖藻黃素、胞外多糖和PUFAs。由此可見,白光可以促進等鞭金藻的生長,而綠光更有利于生物活性物質的積累。今后可采用兩步法(先用白光培養再用綠光培養)培養等鞭金藻,研究是否可顯著提高等鞭金藻細胞生長與生物活性物質的合成,促進等鞭金藻生物活性物質規模化生產。